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      Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)中總維生素E的提取工藝研究Δ

      2019-06-25 01:56:28王紅吳啟南崔永偉伍城穎沈蓓樊修和南京市溧水區(qū)中醫(yī)院藥劑科南京00南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南京003
      中國藥房 2019年11期
      關(guān)鍵詞:中總芡實(shí)無水乙醇

      王紅,吳啟南,崔永偉,伍城穎,沈蓓,樊修和(.南京市溧水區(qū)中醫(yī)院藥劑科,南京00;.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 003)

      芡實(shí)為睡蓮科芡屬一年水生草本植物芡(Euryale feroxSalisb.)的干燥成熟種仁,具有養(yǎng)血安神、益腎固精、補(bǔ)脾止瀉、祛濕止帶的功效[1-2]。在2007年,李美紅等[3]從芡實(shí)中分離純化了不同構(gòu)型的生育酚(α、β、γ、δ-生育酚)類物質(zhì)。生育酚又名維生素E,其中α-生育酚是自然界分布最為廣泛、含量最多且活性最高的維生素E的存在形式[4],作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑[5],其在促進(jìn)性激素分泌、增強(qiáng)免疫功能、對抗自由基氧化等過程中扮演著重要的角色,同時也是芡實(shí)中醫(yī)功效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[6-7]。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法,已被廣泛地用于多因素的試驗(yàn)優(yōu)化[8-11]。本文使用超聲輔助法,以無水乙醇為提取劑,采用高效液相色譜法測定芡實(shí)中總維生素E的含量[12],通過單因素試驗(yàn)考察提取時間、提取次數(shù)、超聲功率、粉碎度對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響,再利用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝條件,為后續(xù)芡實(shí)脂溶性成分的功效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供試驗(yàn)依據(jù),也為芡實(shí)中總維生素E的資源開發(fā)與利用提供參考。

      1 材料

      1.1 儀器

      Waters 2695高效液相色譜儀,配有高精度四元梯度泵、三極管陣列檢測器(PDA)、Empower色譜工作站(美國Waters公司);KH300SP超聲波提取設(shè)備(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);BT125千分之一電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);SAGA-10TY實(shí)驗(yàn)室級超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

      1.2 藥品與試劑

      芡實(shí)藥材采自揚(yáng)州高郵湖,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為真品;α-生育酚(批號:120961,純度:99%)、β-生育酚(批號:120894,純度:99%)、δ-生育酚(批號:121052,純度:99%)對照品均購自美國Sigma公司;抗壞血酸粉末(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:F20100108,試驗(yàn)中防止維生素E氧化);甲醇為色譜純,無水乙醇為分析純,水為自制超純水。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 芡實(shí)中總維生素E的提取

      參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[10],取干燥的芡實(shí)藥材,打粉過80目篩;稱取一定量的芡實(shí)粉末,置于錐形瓶中,依次加入無水乙醇、抗壞血酸溶液(質(zhì)量濃度為0.05 g/mL),超聲(頻率:40 kHz,功率:240 W)提取,過濾,濾液轉(zhuǎn)入球形蒸發(fā)瓶,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收溶劑,得總維生素E干浸膏。

      2.2 芡實(shí)中總維生素E的含量測定

      總維生素E量以α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的總和計(jì)。

      2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇-水溶液(97∶3,V/V);檢測波長為295 nm;柱溫為30℃;流速為1 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

      2.2.2 溶液的制備 (1)混合對照品溶液的制備:分別精密稱取12、5.6、0.96 mg的α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚對照品,至10 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚質(zhì)量濃度分別為1.2、0.56、0.096 mg/mL的混合對照品溶液。(2)供試品溶液的制備:取“2.1”項(xiàng)下制備的干浸膏適量,用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,即得。

      2.2.3 專屬性考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液和供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果,α-生育酚與β-生育酚、β-生育酚與δ-生育酚的分離度均>1.5,以α-生育酚峰計(jì)理論板數(shù)均>2 000。色譜圖見圖1。

      2.2.4 線性關(guān)系、檢測限及定量限考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液0、100、200、500、800 μL至1 mL量瓶中,甲醇定容,取10 μL按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。以α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸,得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的線性回歸方程及線性范圍。另取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量,倍比稀釋,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1時得檢測限,當(dāng)信噪比為10∶1時得定量限。α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的回歸方程、線性范圍、檢測限及定量限見表1。

      圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

      表1 α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的回歸方程、線性范圍、檢測限及定量限Tab 1 Regression equation,linear range,detection limit and quantification limit of α-tocopherol,β-tocopherol and δ-tocopherol

      2.2.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn) 將α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚對照品按相關(guān)方法進(jìn)行操作。結(jié)果,在精密度試驗(yàn)中,α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為1.53%、1.88%、2.06%(n=6),表明該方法精密度良好;在重復(fù)性試驗(yàn)中,α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為2.05%、1.64%、2.18%(n=6),表明該方法的重復(fù)性良好;在穩(wěn)定性試驗(yàn)中,24 h內(nèi)α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為1.36%、2.42%、1.73%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定;加樣回收率試驗(yàn)中,α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的平均加樣回收率分別為98.23%、101.75%、104.32%,RSD分別為1.62%、2.41%、1.55%(n=9)。

      2.3 單因素試驗(yàn)篩選芡實(shí)中總維生素E提取工藝

      在對芡實(shí)中總維生素E的提取過程中,藥材的提取時間、提取次數(shù)、超聲功率、粉碎度等因素對提取率有著重要的影響[13-17]。因此在本試驗(yàn)中,選擇上述因素進(jìn)行考察。

      2.3.1 提取時間 稱取60目芡實(shí)粉末6份,每份2 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,依次加入60 mL無水乙醇,10 mL抗壞血酸,在超聲功率為240 W的條件下提取1次,考察不同提取時間(10、20、30、60、120、180 min)對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。結(jié)果,隨著提取時間的增加,芡實(shí)中總維生素E提取量先呈上升趨勢,當(dāng)提取時間為60 min時,總維生素E提取量最高(1.644 mg/g),再增加提取時間總維生素E提取量呈下降趨勢,由此確定芡實(shí)中總維生素E超聲提取時間為60 min,詳見圖2A。

      圖2 各因素對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響Fig 2 Effects of each factor on the extraction amount of total vitamin E in E.ferox

      2.3.2 提取次數(shù) 稱取60目芡實(shí)粉末6份,每份2 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,依次加入60 mL無水乙醇,10 mL抗壞血酸,提取時間為60 min,超聲功率為240 W的條件下分別提取1、2、3、4、5、6次,考察不同提取次數(shù)對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。結(jié)果,隨著超聲提取次數(shù)的增加,芡實(shí)中總維生素E提取量先呈上升趨勢,當(dāng)提取次數(shù)為3次時,總維生素E提取量最高(1.754 mg/g),再增加提取次數(shù)總維生素E提取量呈下降趨勢,由此確定芡實(shí)中總維生素E超聲提取次數(shù)為3次,詳見圖2B。

      2.3.3 超聲功率 稱取60目芡實(shí)粉末6份,每份2 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,依次加入60 mL無水乙醇,10 mL抗壞血酸,提取時間為60 min,分別以超聲功率150、180、210、240、270、300 W提取1次,考察不同超聲功率對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。結(jié)果,隨著超聲功率的增加,芡實(shí)中總維生素E提取量先呈上升趨勢,當(dāng)超聲功率達(dá)到240 W時,總維生素E提取量最高(1.786 mg/g),再提高超聲功率總維生素E提取量呈下降趨勢,由此確定芡實(shí)中總維生素E超聲的功率為240 W,詳見圖2C。

      2.3.4 粉碎度 稱取芡實(shí)過篩20、40、60、80、100、120目粉末各1份,每份2 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,依次加入60 mL無水乙醇,10 mL抗壞血酸,超聲功率為240 W,提取時間為60 min,考察不同粉碎度對對芡實(shí)中總維生素E提取量影響。結(jié)果,隨著粉碎度的增加,芡實(shí)中總維生素E提取量呈上升趨勢,當(dāng)粉碎度達(dá)到80目,總維生素E提取量最高(1.742 mg/g),再提高粉碎度,總維生素E提取量呈下降趨勢,由此確定芡實(shí)中總維生素E的粉碎度為80目,詳見圖2D。

      2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)中總維生素E的提取工藝

      2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以提取時間(X1)、提取次數(shù)(X2)、超聲功率(X3)、粉碎度(X4)為自變量(Xi),總維生素E提取量(Y)作為響應(yīng)值,采用中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,在4因素3水平的基礎(chǔ)上,運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化芡實(shí)總維生素E的最佳提取工藝,因素與水平見表2,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

      表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

      表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3 Design and results of tests

      2.4.2 模型建立與方差分析 采用Design-Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)并分析處理相關(guān)數(shù)據(jù),得到二次多項(xiàng)回歸方程Y=2.04+0.12X1+0.34X2+0.10X3+0.088X4+0.073X1X2-0.099X1X3-0.023X1X4-0.13X2X3-0.049X2X4-0.091X3X4-0.49X12-0.30X22-0.40X32-0.49X42(R2=0.952 5)。方差分析結(jié)果見表4。

      由表4可知,該模型的P<0.000 1,表明虛擬模型顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;提取次數(shù)、提取時間、超聲功率對芡實(shí)總維生素E提取量的影響顯著,各因素的二次項(xiàng)系數(shù)也均對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響顯著;交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4對芡實(shí)中總維生素E含量的影響不顯著,各因素對芡實(shí)中總維生素E提取量影響的大小順序依次為X2>X1>X3>X4。

      表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

      2.4.3 響應(yīng)面分析 利用Design-Expert V 8.0.6軟件分析,得出影響芡實(shí)中總維生素E提取量的各因素交互作用的相應(yīng)響應(yīng)面圖,各因素對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響見圖3。

      由圖3可知,提取時間與超聲功率之間、提取時間與粉碎度之間、超聲功率與粉碎度之間的交互作用增強(qiáng),但還未達(dá)到顯著水平,而提取次數(shù)與提取時間之間、提取次數(shù)與超聲功率之間、提取次數(shù)與粉碎度之間的交互作用不顯著,總維生素E的提取量隨著提取時間、超聲功率、粉碎度三者之間的交互作用呈現(xiàn)由低到高再到低的趨勢。因此,在適合的提取時間、超聲功率、粉碎度下,總維生素E的提取量會出現(xiàn)極大值,且應(yīng)位于響應(yīng)面的頂部。由Design-Expert V 8.0.6軟件分析得出:在穩(wěn)定狀態(tài)下芡實(shí)中總維生素E提取量的最大值為2.153 mg/g,相對應(yīng)的提取時間為80.49 min、提取次數(shù)為3.54次、超聲功率為242.69 W、粉碎度為80.44目。以實(shí)際操作的方便考慮,將其修正為提取時間80 min、提取次數(shù)3次、超聲功率240 W、粉碎度80目。

      2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化提取工藝,分別取芡實(shí)藥材2、20、40 g進(jìn)行3次平行試驗(yàn),結(jié)果,總維生素E的提取量分別為2.063、2.103、2.085 mg/g(RSD分別為2.6%、1.5%、1.3%,n=3),與預(yù)測值2.092 mg/g的相對誤差分別為0.14%、0.53%、0.33%,提示3次驗(yàn)證試驗(yàn)的總維生素E提取量差異較小,說明該工藝穩(wěn)定可靠。

      圖3 各因素與芡實(shí)中總維生素E提取量之間的響應(yīng)面圖Fig 3 Response surface plots for each factors on the extraction amount of total vitamin E in E.ferox

      3 討論

      中藥芡實(shí)的化學(xué)成分多樣,但由于其含有大量淀粉,加大了分離芡實(shí)藥效成分的難度。為了優(yōu)化芡實(shí)總維生素E的提取工藝,筆者通過預(yù)試驗(yàn),先后考察了提取方法、提取溶劑的種類、提取次數(shù)、提取時間、超聲功率、粉碎度等對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響。在提取方法方面,筆者比較了回流法、超聲法與索氏提取法,結(jié)果超聲法提取效果最好,操作簡單;隨后,又考察了以石油醚、無水乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、甲醛等為溶劑對提取量的影響,結(jié)果以無水乙醇為溶劑提取效果最好。綜合考慮,提取時間、提取次數(shù)、超聲功率、粉碎度對芡實(shí)中總維生素E提取量的影響較大,故選擇這4個因素對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

      本研究結(jié)果顯示,隨著提取時間的延長,總維生素E的提取量先上升后下降,推測其原因可以與其易氧化有關(guān),導(dǎo)致維生素E的化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞,提取量降低;隨著超聲功率變大,總維生素E的提取量不斷增加,但過強(qiáng)的超聲功率會破壞芡實(shí)中維生素E的結(jié)構(gòu),故維生素E的提取率隨超聲功率的增強(qiáng)呈先上升后下降的趨勢;粒度過粗的芡實(shí)粉末由于與溶劑的接觸面積小,提取效率低,粒度過細(xì)的芡實(shí)粉末使得分子與分子間的吸附作用增強(qiáng),故隨著芡實(shí)粉碎度的增加,維生素E的提取量也是呈先上升后下降的趨勢。

      綜上所述,本文通過Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法成功優(yōu)化了芡實(shí)中總維生素E的提取工藝,且優(yōu)化后的提取工藝合理可行,可為芡實(shí)中總維生素E的開發(fā)與利用提供參考。

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