玉米ZmGRAS31基因的克隆及功能研究

殷龍飛 王朝陽(yáng) 吳忠義 張中保,* 于 榮,*

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玉米基因的克隆及功能研究

殷龍飛1,2王朝陽(yáng)1吳忠義2張中保2,*于 榮1,*

1首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100048;2北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心/ 北京市農(nóng)業(yè)基因資源和生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100097

GRAS蛋白家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 在多種植物中均有報(bào)道。為了探究玉米基因家族在逆境脅迫下的功能, 本研究從玉米根中克隆獲得(AC: NC_024462), 該基因全長(zhǎng)1422 bp, 編碼473個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明ZmGRAS31蛋白分子量為51,700.38 Da, 理論等電點(diǎn)為4.73, 具有GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族特有的保守結(jié)構(gòu)域, 但不具跨膜結(jié)構(gòu), 親水性較差。玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明ZmGRAS31定位于細(xì)胞核內(nèi)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)分析表明, 在低溫、脫水、高鹽、干旱處理下,在玉米幼苗均上調(diào)表達(dá); 不同濃度NaCl處理過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株, 其根長(zhǎng)優(yōu)于野生型, 由此推測(cè)該基因可能參與玉米非生物脅迫應(yīng)答。

玉米;; 轉(zhuǎn)錄因子; 原生質(zhì)體; qPCR; 非生物脅迫

玉米(L.)不僅是重要的糧食和飼料作物, 也是重要的食品工業(yè)原料和能源植物[1]。玉米起源于南美洲高溫多濕的熱帶地區(qū), 喜高溫、需水較多、耐旱性不強(qiáng), 對(duì)鹽脅迫中度敏感, 耐鹽性較差[2]。土壤干旱、鹽堿化嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量, 隨著生態(tài)環(huán)境的破壞, 如何提高玉米對(duì)干旱、高鹽等不利因素的抵抗能力越來(lái)越受到重視。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)又稱為反式作用因子, 在真核生物細(xì)胞中能夠結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域激活或抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá), 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3]。近年來(lái), 研究人員陸續(xù)從高等植物體內(nèi)分離出一些與干旱、高鹽堿、低溫脅迫以及激素和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子; 主要可分為MYB (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)[4-6]、Bzip (Basicreg ion/leuci nezipper)[7-9]、CBF/DREB (C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding protein)[10-12]、NAC (NAM, ATAF1/2, CUC1/2)[13-15]、WRKY[16-17]、HD-START (homeodomain-StAR-related lipid transfer)[18]、GRAS (GAI, RGA, SCR)[19-20]等幾大類。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游逆境應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)從而改善植物非生物脅迫抵抗能力; 因此, 轉(zhuǎn)錄因子在抗逆研究中起非常重要的作用。

GRAS家族是近年來(lái)在高等植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄因子, 廣泛存在于植物體內(nèi)。典型的GRAS蛋白由400~700個(gè)氨基酸組成, 高度保守的羧基端含有核心基序VHIID, 存在于所有家族成員中。模式植物擬南芥和水稻GRAS家族成員可分為8個(gè)亞族即SCL3 (scarecrow-like 3)、LISCL (SCL9被重命名為L(zhǎng)ISCL)、SHR (short-root)、PAT1 (phytochrome a signal transduction 1)、DELLA、SCR (scarecrow)、LS (lateral suppressor)和HAM (hairy meristem)[20]。GRAS家族成員功能多樣, 調(diào)控許多重要的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。植物轉(zhuǎn)錄因子的研究熱點(diǎn)主要集中在抗逆脅迫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、根瘤和菌根的形成等方面。其中, HAM亞家族主要維持莖尖分生組織處于未分化狀態(tài); 在矮牽牛突變體中, 莖尖分生組織不能保持其未分化的特征[21]。非細(xì)胞自主性(non-cell-autonomously)功能來(lái)源于側(cè)向器官原基(lateral organ primordial)和莖原維管組織(stem provascular tissue)的L3細(xì)胞, 該功能對(duì)莖尖分生組織的維持非常重要[22]。但是, 關(guān)于HAM亞家族基因在玉米逆境脅迫應(yīng)答中所起的作用還未見(jiàn)報(bào)道, 本研究克隆了玉米HAM亞家族成員基因, 研究了該基因的表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位和在高鹽、脫水、低溫、干旱等脅迫處理下的表達(dá)情況; 以及鹽、甘露醇處理下對(duì)過(guò)表達(dá)該基因擬南芥根長(zhǎng)的影響, 旨在深入了解GRAS蛋白家族的生理功能, 為農(nóng)作物抵御干旱, 增加產(chǎn)量提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

溫室中種植玉米骨干自交系B73, 生長(zhǎng)到三葉一心時(shí)期進(jìn)行不同逆境處理; 黑暗條件下種植玉米骨干自交系鄭58, 取黃化苗胚芽鞘提取原生質(zhì)體進(jìn)行基因亞細(xì)胞定位。農(nóng)桿菌GV3101為本實(shí)驗(yàn)室保存, 大腸桿菌Trans1T1(貨號(hào)M2650817)、pEASY T5Zero Clone載體(貨號(hào)M20801)、RNA提取試劑盒(貨號(hào)M30902)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(M30919)等均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司, Ex(貨號(hào)AI12716A)、LA(貨號(hào)AI10495A)、SYBRPremix ExII (Tli RNaseH Plus)(AI40782A)等購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司,I (貨號(hào)R0191L)、I (貨號(hào)R0552L)內(nèi)切酶購(gòu)于NEB (北京)公司,R I (1040B)、I (1068B)內(nèi)切酶購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司; 低溫臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)MUITLFUGE X1R)購(gòu)于賽默飛公司, 低溫臺(tái)式水平離心機(jī)(型號(hào)SC-3612)購(gòu)于中佳公司; PCR儀(型號(hào)T100 Thermal Cycler)購(gòu)于伯樂(lè)公司; 應(yīng)用Image J統(tǒng)計(jì)分析擬南芥根長(zhǎng)。

1.2 玉米總RNA的提取及ZmGRAS31 cDNA的克隆

按照全式金Transzol Up Plus RNA Kit試劑盒的說(shuō)明提取玉米根組織的總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。設(shè)計(jì)引物pZmGRAS31-F、pZmGRAS31-R, 以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性60 s; 98°C 10 s, 68°C 120 s, 30個(gè)循環(huán); 72°C 延伸10 min, 獲得全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至T5Zero載體, 獲得單克隆后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行菌落測(cè)序。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用的引物

1.3 玉米ZmGRAS31基因的亞細(xì)胞定位

1.3.1 植物表達(dá)載體pYBA1132:ZmGRAS31:EGFP的構(gòu)建 使用引物pZmGRAS31SL-F、pZmGRAS31SL-R擴(kuò)增獲得基因含有酶切位點(diǎn)的編碼區(qū), PCR產(chǎn)物經(jīng)R I、I雙酶切連接至PYBA1132表達(dá)載體上獲得重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Trans1T1)后, 挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 玉米原生質(zhì)體的提取及轉(zhuǎn)化 以玉米自交系鄭58黃化苗胚芽鞘為材料, 依據(jù)Yoo的方法[23]提取原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)化。配制母液: 0.8 mol L–1甘露醇、0.2 mol L–1MES-KOH (pH 5.7)、1 mol L–1KCl、1 mol L–1CaCl2、1 mol L–1NaCl、1 mol L–1MgCl2、0.1 mg mL–1BAS。使用新鮮酶溶液及PEG-Ca2+(40%, v/v)溶液, WI (0.5 mol L–1甘露醇、4 mol L–1MES-KOH、20 mmol L–1KCl )、W5 (154 mmol L–1NaCl、125 mol L–1CaCl2、5 mmol L–1KCl、2 mmol L–1MES, pH 5.7)、MMG (0.4 mol L–1甘露醇、4 mmol L–1MES, pH 5.7)溶液均由母液與ddH2O按說(shuō)明配制。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體室溫黑暗孵育16 h加入0.1% Tween 20, 輕輕混勻后再加入終濃度為5 μmol L–1的DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindole)染色5 min, 經(jīng)PBS緩沖液洗滌后于激光共聚焦顯微鏡(zeiss 780)下觀看熒光情況。

1.4 玉米ZmGRAS31基因的抗逆表達(dá)及組織差異表達(dá)——qPCR分析

挑選飽滿的自交系B73種子種植于溫室花盆中, 分別設(shè)置對(duì)照組、脫水處理組、鹽(200 mmol L–1NaCl)處理組、冷(4℃)處理組、干旱處理組, 每組6盆, 每盆2顆, 各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。玉米幼苗正常生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)期分別進(jìn)行脫水、高鹽、冷、干旱處理, 取脫水、高鹽、冷處理0 h、1 h、2 h、5 h、10 h、24 h后的地上部和根, ?80℃凍存。干旱組取處理0 d、3 d、7 d、12 d后的地上部和根, ?80℃凍存。取組織差異表達(dá)材料幼苗的根、葉以及抽雄期的根、莖、葉、雄穗、花絲、幼胚, ?80℃凍存。

按照試劑盒的說(shuō)明提取地上部及根RNA, 逆轉(zhuǎn)錄后作為qPCR模板。設(shè)計(jì)特異引物pZmGRAS31RT- F、pZmGRAS31RT-R及內(nèi)參基因特異引物pGAPDHRT-F、pGAPDHRT-R。應(yīng)用ABI Step One Plus Real-time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL 2×SYBR Premix Ex、0.4 μL GSP (10 μmol L–1)、1 μL cDNA模板、0.4 μL ROX、7.8 μL ddH2O。PCR條件為95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 共40個(gè)循環(huán); 融解曲線分析的Step 1: 95℃ 15 s; Step 2: 60℃ 1 min; Step 3: 95℃ 15 s。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)樣本, 每個(gè)生物學(xué)樣本設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù), 數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。應(yīng)用2–??CT方法分析在各組織中的相對(duì)表達(dá)情況[24]。逆境處理實(shí)驗(yàn)分別以0 h幼苗的根和地上部中的表達(dá)量計(jì)為1, 組織差異表達(dá)實(shí)驗(yàn)中以抽雄期的根組織中的表達(dá)量計(jì)為1。

1.5 植物過(guò)表達(dá)載體p4301:ZmGRAS31的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

1.5.1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物pZmGRAS31At-F、pZmGRAS31At-R擴(kuò)增的編碼區(qū)片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)I、I酶切消化后連接到TOPO載體上, 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans110 (非甲基化), 經(jīng)含有壯觀霉素抗性固體培養(yǎng)基篩選后, 挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌體PCR檢驗(yàn)及酶切驗(yàn)證, 并送測(cè)序。

1.5.2 Gateway目的載體(Destination Vector)的構(gòu)建

按Invitrogen Gateway LR Clonase II Enzyme Mix試劑盒說(shuō)明, 將TOPO載體上目的基因轉(zhuǎn)移到含有att R1、att R2重組位點(diǎn)的pCAMBIA4301載體上, 構(gòu)建pCAMBIA4301:ZmGRAS31重組質(zhì)粒。

1.5.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101及侵染擬南芥 將pCAMBIA4301:ZmGRAS31重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101, 篩選鑒定后通過(guò)浸花法侵染擬南芥[25]。單株收取T0代種子, 經(jīng)卡那霉素抗性篩選后獲得T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥。提取T1代幼苗葉片基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè), 擴(kuò)增引物為pZmGRAS31-F、pZmGRAS31-R, 產(chǎn)物連到T載體后送測(cè)序驗(yàn)證。單株收獲陽(yáng)性植株種子并加代獲得T3代純合植株。

1.5.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子逆境處理 利用含NaCl、甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥分別模擬鹽、干旱脅迫。配制梯度濃度的1/2 MS培養(yǎng)基。NaCl濃度梯度為0 mol L–1、0.1 mol L–1、0.15 mol L–1、0.20 mol L–1, 甘露醇濃度梯度為0 mol L–1、0.15 mol L–1、0.30 mmol L–1、0.45 mol L–1, 調(diào)pH 5.8。將1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗(根長(zhǎng)相同), 分別移栽到含不同濃度NaCl、甘露醇的1/2 MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分為兩部分, 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥各移3株, 設(shè)3個(gè)重復(fù), 垂直放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 7 d后統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng), 重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmGRAS31基因序列擴(kuò)增

基因編碼序列全長(zhǎng)1422 bp, 編碼473個(gè)氨基酸。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn), ZmGRAS31蛋白包含GRAS保守結(jié)構(gòu)域(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)(圖1)。生物信息學(xué)分析表明該蛋白分子量為51,700.38 Da, 理論等電點(diǎn)為4.73; 不具跨膜結(jié)構(gòu), 親水性較差, ZmGRAS31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主(50.32%)。

2.2 玉米原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pYBA1132:ZmGRAS31: EGFP并轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體, 通過(guò)(Enhanced green fluorescent protein)融合蛋白的熒光顯示目的蛋白的亞細(xì)胞定位。原生質(zhì)體經(jīng)DAPI染色后于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 帶有目的基因的GFP融合蛋白綠色熒光只分布在細(xì)胞核, 并且與核特異染料DAPI的藍(lán)色熒光完全重合(圖2), 表明ZmGRAS31是一個(gè)核蛋白。

2.3 玉米ZmGRAS31基因在不同組織中的表達(dá)情況

分別提取幼苗的根、葉及抽雄期的根、莖、葉、雄穗、花絲、幼胚組織總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行qPCR分析表明,在不同組織中表達(dá)差異較大, 以抽雄期根中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較, 幼根中的表達(dá)量最高, 約為成熟根中表達(dá)量的17.7倍; 其次是雄穗表達(dá)量約為1.6倍; 其他組織的表達(dá)量均低于成熟根中, 花絲中的表達(dá)量最低(圖3)。由此推測(cè)可能在幼根生長(zhǎng)及雄配子形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖1 玉米ZmGRAS31基因保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖2 玉米ZmGRAS31蛋白在原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位

GFP: GFP標(biāo)記的1基因在玉米原生質(zhì)體的亞細(xì)胞定位; DAPI: DAPI標(biāo)記的原生質(zhì)體細(xì)胞核; Bright: 同一視野光鏡下的原生質(zhì)體; Merged: 光鏡及熒光照片的疊加; CK: 轉(zhuǎn)入空載體的原生質(zhì)體;: 轉(zhuǎn)入目的載體的原生質(zhì)體。Bar=10 μm。

GFP: subcellular localization of the GFP-ZmGRAS31 fusion protein in maize protoplast; DAPI: DAPI-labeled protoplast nucleus; Bright: protoplast under the same field; Merged: merge of GFP, DAPI, and bright; CK: protoplast with empty vector;: protoplast with destination vector. Bar=10 μm.

圖3 ZmGRAS31在玉米不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 不同逆境處理對(duì)玉米幼苗ZmGRAS31基因表達(dá)的影響

應(yīng)用2–??CT方法分析各處理下的表達(dá)情況。脫水處理下, 地上部的表達(dá)量在5 h內(nèi)逐漸上調(diào)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照的18.7倍, 至24 h表達(dá)量約為對(duì)照的2.4倍; 根中的表達(dá)量也是逐步上調(diào)并在5 h時(shí)到達(dá)峰值, 約為對(duì)照的7.5倍, 到24 h時(shí)約下調(diào)至對(duì)照水平(0.78倍)(圖4-A)。低溫處理下, 如圖4-B所示, 地上部的表達(dá)量先上調(diào)然后回落隨后又上調(diào), 并在5 h時(shí)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照的6.6倍; 5 h后下調(diào)明顯, 至24 h時(shí)約為對(duì)照的0.3倍; 根中迅速上調(diào)至對(duì)照4.0倍左右并維持到5 h, 到24 h時(shí)下調(diào)至對(duì)照0.2倍左右。鹽處理下, 地上部迅速上調(diào), 1 h時(shí)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照2.5倍, 隨后下調(diào)至對(duì)照0.5倍左右。根中逐漸上調(diào)并在5 h時(shí)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照1.8倍, 到24 h時(shí)下調(diào)至對(duì)照0.45倍左右(圖4-C)。干旱處理下, 地上部分在3 d內(nèi)呈上調(diào)趨勢(shì), 3 d時(shí)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照11倍, 隨后下調(diào)至12 d時(shí),的表達(dá)量約為對(duì)照2.5倍; 根中也是在3 d時(shí)達(dá)到峰值, 約為對(duì)照16倍, 隨后下調(diào), 至12 d時(shí)約為對(duì)照0.5倍(圖4-D)。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同處理?xiàng)l件下ZmGRAS31基因在地上部和根中的表達(dá)情況

A: 脫水處理; B: 低溫(4°C)處理; C: 高鹽(200 mmol L–1NaCl); D: 干旱處理。數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

A: dehydration treatment; B: cold (4°C) treatment; C: high salt (200 mmol L–1NaCl) treatment; D: drought treatment. The error bar represents ± SD of triplicate experiments.

2.5 轉(zhuǎn)ZmGRAS31基因擬南芥的耐鹽性分析

提取具卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片DNA進(jìn)行PCR檢測(cè), 鑒定有5株轉(zhuǎn)基因擬南芥含有目的基因, qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中基因的表達(dá)水平, 選取表達(dá)量最高的兩株系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽、耐甘露醇實(shí)驗(yàn)(結(jié)果未展示)。0 mol L–1NaCl濃度時(shí)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng)(圖5-A), 當(dāng)NaCl濃度為0.10 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng), 轉(zhuǎn)基因擬南芥主根比野生型長(zhǎng), 差異顯著(<0.05)(圖5-B)。當(dāng)NaCl濃度為0.15 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均不能正常生長(zhǎng), 整體表現(xiàn)為株型偏小, 葉片發(fā)黃, 無(wú)或很少側(cè)根但轉(zhuǎn)基因擬南芥的主根比野生型長(zhǎng), 差異顯著(<0.05)(圖5-C)。當(dāng)NaCl濃度升為0.20 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均不能正常生長(zhǎng), 葉片發(fā)黃枯死, 主根不生長(zhǎng), 無(wú)側(cè)根(圖5-D)。統(tǒng)計(jì)分析野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)(圖5-E)。

圖5 不同鹽濃度下轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)比較

A~D分別為0 mol L–1、0.10 mol L–1、0.15 mol L–1、0.20 mol L–1NaCl處理的生長(zhǎng)情況; E: 不同鹽濃度下擬南芥平均主根長(zhǎng)度; WT: 野生型擬南芥; OE: 過(guò)表達(dá)擬南芥。Bar = 1.5 cm。

A–D was seedling growth under the NaCl concentrations of 0 mol L–1, 0.10 mol L–1, 0.15 mol L–1, and 0.20 mol L–1; E: the average main root length ofat different NaCl concentrations. WT: wild type; OE: overexpression.Bar = 1.5 cm.

2.6 轉(zhuǎn)ZmGRAS31基因擬南芥的耐甘露醇分析

0 mol L–1甘露醇濃度時(shí)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能生長(zhǎng)(圖6-A), 當(dāng)甘露醇濃度為0.15 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng), 根長(zhǎng)沒(méi)有明顯差異, 植株均偏小, 側(cè)根較少(圖6-B)。當(dāng)甘露醇濃度為0.30 mol L–1時(shí), 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥長(zhǎng)勢(shì)較弱, 轉(zhuǎn)基因擬南芥主根比野生型長(zhǎng), 差異不明顯但葉片較黃(圖6-C)。當(dāng)甘露醇濃度為0.45 mol L–1時(shí), 兩種擬南芥均不能生長(zhǎng), 植株細(xì)小, 葉片均發(fā)黃(圖6-D)。統(tǒng)計(jì)分析野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)(圖6-E)。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子是能與真核基因順式作用元件相互作用的DNA結(jié)合蛋白, 起激活或者抑制轉(zhuǎn)錄的作用。GRAS家族是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 得名于最先發(fā)現(xiàn)的GAI (gibberellic acid insensitive)、RGA (repressor of GA1-3 mutant) 和SCR (scarecrow)[19]三個(gè)成員; 可分為八個(gè)亞族。GRAS家族成員眾多, 功能各異, 參與調(diào)控許多重要的生理途徑; 然而玉米中只有D8[26]、D9[27]、SCR[28]等少數(shù)幾個(gè)成員被報(bào)道。本研究克隆了玉米基因的cDNA序列, ZmGRAS31蛋白被定位于細(xì)胞核, 具有GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族特有的保守結(jié)構(gòu)域。

圖6 不同甘露醇濃度下轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)比較

A~D分別為0 mol L–1、0.15 mol L–1、0.30 mol L–1、0.45 mol L–1甘露醇處理的生長(zhǎng)情況; E: 不同甘露醇濃度下擬南芥平均主根長(zhǎng)度, WT: 野生型擬南芥; OE: 過(guò)表達(dá)擬南芥。Bar=1.5 cm。

A–D was seedling growth under the mannitol concentrations of 0 mol L–1, 0.15 mol L–1, 0.30 mol L–1, and 0.40 mol L–1; E: the averagemain root length ofat different mannitol concentrations. WT: wild type; OE: overexpression. Bar = 1.5 cm.

近年來(lái), 越來(lái)越多的研究關(guān)注GRAS家族在響應(yīng)植物脅迫中的作用。Tanabe等[29]發(fā)現(xiàn)水稻基因可以通過(guò)調(diào)控的表達(dá)來(lái)抑制病原菌侵染水稻后的死亡率, 提高了水稻對(duì)病原菌的抗性。李麗麗等[30]研究表明獨(dú)行菜基因在低溫脅迫下表達(dá)量顯著升高, 推測(cè)該基因與獨(dú)行菜幼苗耐低溫有關(guān)。郭華軍等[31]利用基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析了擬南芥GRAS家族響應(yīng)滲透和干旱脅迫的表達(dá)模式。馬洪雙等[32]將胡楊基因轉(zhuǎn)入擬南芥, 顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱和抗鹽能力。張煥欣等[33]利用生物信息學(xué)手段對(duì)辣椒GRAS家族基因進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和進(jìn)化分析, 發(fā)現(xiàn)多數(shù)辣椒GRAS基因能響應(yīng)PEG-6000和鹽脅迫。郭鵬等[34]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)玉米基因的煙草內(nèi)葉綠素含量和光合效率均有較大提高, 增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽能力。李慧聰?shù)萚35]發(fā)現(xiàn)玉米基因通過(guò) H2O2信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)42oC熱激和ABA脅迫的響應(yīng)。

本研究表明該基因在不同時(shí)期的多種組織中均有表達(dá), 其中以幼根的表達(dá)量最高, 其次是雄穗, 因此推測(cè)可能參與幼根生長(zhǎng)和下胚軸伸長(zhǎng), 而在成熟植株雄穗內(nèi)可能調(diào)控雄配子的形成。同時(shí),在脫水、低溫、高鹽、干旱等逆境處理中的表達(dá)量均有不同程度上調(diào), 最高分別能達(dá)到對(duì)照的18.7、6.6、2.5、15.9倍, 推測(cè)參與植株體內(nèi)抗旱、抗寒及抗鹽等逆境脅迫應(yīng)答。鹽處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的主根比野生型長(zhǎng), 差異顯著; 而在甘露醇模擬干旱處理實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型無(wú)顯著差異。進(jìn)一步探索基因抗逆機(jī)制發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游2 kb的DNA序列有多個(gè)與逆境脅迫、光反應(yīng)等功能相關(guān)的順式作用元件。如ABRE、C-repeat/DRE、G-box、MBS、HSE、TC-rich repeats, 它們分別響應(yīng)ABA、冷/脫水、光、干旱、熱、防御和應(yīng)激反應(yīng)。其中ABRE、MBS分別是與ABA、MYB蛋白相關(guān)的順式作用元件, 而ABA和MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的多種耐鹽、耐旱過(guò)程[36-38]。在MaizeGDB (https://www.maizegdb.org/)中查詢結(jié)果表明,位于第4染色體210 Mbp~220 Mbp之間并且目前還沒(méi)有相關(guān)的QTL數(shù)據(jù)。Tuberosa[39]等用Lo964× Lo1016群體研究發(fā)現(xiàn), 在第4染色體的umc66A- umc156A區(qū)段定位到水分脅迫下產(chǎn)量和主胚根長(zhǎng)的QTL。潘清春利用478 X Wu312 重組自交系群體研究發(fā)現(xiàn), 在第5和第6染色體上存在根系與產(chǎn)量性狀QTLs連鎖, 并且在第5染色體的bnlg1879- umc1447區(qū)段, 定位到了低氮下最大根長(zhǎng)和產(chǎn)量的位點(diǎn)[40]。作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子, 其表達(dá)產(chǎn)物可能會(huì)與玉米根長(zhǎng)或抗旱相關(guān)的QTL結(jié)合, 調(diào)控玉米的根系發(fā)育進(jìn)而影響產(chǎn)量。

4 結(jié)論

玉米HAM亞族轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA全長(zhǎng)1422 bp, 編碼473個(gè)氨基酸, 其編碼蛋白定位于細(xì)胞核。正常生長(zhǎng)情況下, 該基因在多個(gè)玉米組織器官中表達(dá), 其中在幼根中的表達(dá)量最高; 該基因響應(yīng)脫水、高鹽、低溫等逆境脅迫并呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式; 轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)在含0.10 mol L–1、0.15 mol L–1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上與野生型有顯著差異; 而在含梯度濃度甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基上與野生型無(wú)明顯差異。

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Cloning and functional analysis ofgene in maize

YIN Long-Fei1,2, WANG Zhao-Yang1, WU Zhong-Yi2, ZHANG Zhong-Bao2,*, and YU Rong1,*

1College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048;2Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Beijing Key Laboratory of Agricultural Gene Resources and Biotechnology, Beijing 100097, China

Thegene family is a kind of plant-specific transcription factor reported in many plants. To figure out the function of maizefamily under stress, we obtained9 (AC: NC_024462) gene from maize () root. Sequence analysis showed that the coding sequence (CDS) ofwas 1422 bp encoding a protein of 473 amino acids with molecular weight of 51,700.38 Da and an isoelectric point of 4.73. Bioinformatics analysis revealed thathad a conserved domain unique to the GRAS transcription factor family and poor hydrophilicity, but no transmembrane structure. Transient expression of maize protoplasts indicated that ZmGRAS31 was localized in the nucleus. Real-time quantitative PCR analysis showed that the expression ofwas up-regulated in maize seedlings under low temperature, dehydration, high salinity and drought conditions. The root length of theoverexpression transgenicplants was longer than that of wide type under different concentrations of NaCl treatments. Therefore, our data suggested thatmight be involved in abiotic stress response.

maize;; transcription factor; protoplast; qPCR; abiotic stress

2018-11-07;

2019-01-19;

2019-03-22.

10.3724/SP.J.1006.2019.83070

于榮, E-mail: yurong@mail.cnu.edu.cn; 張中保, E-mail: zhangzhongbao@baafs.net.cn

E-mail: 18810259769@163.com

本研究由北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(6172007), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31871351)和北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20180404)資助。

This study was supported by the Beijing Natural Science Foundation (6172007), the National Natural Science Foundation of China (31871351), and the Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences (KJCX20180404).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190321.1508.006.html