雨生紅球藻和小球藻間的原生質(zhì)體融合與糖異養(yǎng)融合子篩選

徐曉瑩,史文凱,袁冠華,張文蕾,張 維，*,崔玉琳,劉天中

(1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266101; 2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049; 3.煙臺(tái)市水產(chǎn)研究所,山東煙臺(tái) 264003; 4.中國科學(xué)院海岸帶研究所,海岸帶生物學(xué)與生物資源利用所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東煙臺(tái) 264003)

天然蝦青素是世界上最強(qiáng)的天然抗氧化劑[1],廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)。雨生紅球藻是生產(chǎn)天然蝦青素的最好生物材料,其含量可達(dá)干重的2.0%～5.0%,為自然界中蝦青素含量最高的生物[2-4]。目前,雨生紅球藻已實(shí)現(xiàn)規(guī)模化的養(yǎng)殖與蝦青素的商業(yè)化生產(chǎn),市場規(guī)模已達(dá)六億美元,并正在以每年10%的速度快速增長。然而長期以來,雨生紅球藻的養(yǎng)殖一直依賴于光合自養(yǎng),生產(chǎn)受到地理、天氣等自然環(huán)境條件的限制,同時(shí)由于雨生紅球藻本身的特性,其生長極其緩慢,遠(yuǎn)不及小球藻、螺旋藻等經(jīng)濟(jì)微藻[5-6],因而目前規(guī)?；B(yǎng)殖效率不高。

除自養(yǎng)生長外,雨生紅球藻也可以進(jìn)行異養(yǎng)生長。乙酸(鹽)是目前雨生紅球藻已知的唯一能夠有效利用的底物[7-10]。Hata等[11]和Wan等[12]均將乙酸鹽異養(yǎng)發(fā)酵引入雨生紅球藻的細(xì)胞培養(yǎng)過程,蝦青素產(chǎn)率分別可達(dá)4.4和6.4 mg/L/d,但乙酸鹽對藻細(xì)胞生長有明顯的底物抑制,因此要建立基于乙酸鹽的雨生紅球藻異養(yǎng)發(fā)酵,必須嚴(yán)格控制培養(yǎng)過程中乙酸鹽底物的濃度。在大多數(shù)微生物發(fā)酵中,葡萄糖是原料最為豐富、應(yīng)用最廣的有機(jī)碳底物。如果雨生紅球藻能夠利用葡萄糖底物進(jìn)行高密度異養(yǎng)發(fā)酵,無疑將大大解決天然蝦青素生產(chǎn)的穩(wěn)定性、規(guī)模化和成本問題,促進(jìn)天然蝦青素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此向雨生紅球藻中引入葡萄糖代謝途徑以獲得可利用葡萄糖的異養(yǎng)株,成為目前雨生紅球藻技術(shù)研發(fā)的熱點(diǎn)。

Zaslavskaia等[13]通過向三角褐指藻中引入功能的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,成功使三角褐指藻獲得了利用葡萄糖進(jìn)行異養(yǎng)生長的能力,但在另外的研究如向團(tuán)藻[14]和細(xì)柱藻[15]中引入該基因卻未能使其發(fā)揮異養(yǎng)作用。對此有學(xué)者認(rèn)為對于團(tuán)藻和細(xì)柱藻等,藻類細(xì)胞本身可能缺失糖代謝過程的關(guān)鍵途徑[16-17]。也有研究認(rèn)為藻類無法異養(yǎng)生長的主要原因在于不完整的三羧酸循環(huán)途徑[18],然而細(xì)胞內(nèi)糖代謝途徑涉及的過程復(fù)雜,相關(guān)的功能基因也非常繁多,到目前為止有關(guān)藻類細(xì)胞異養(yǎng)功能缺失的代謝機(jī)制仍不清楚。對于雨生紅球藻,缺乏相關(guān)的基因組學(xué)數(shù)據(jù),對其代謝途徑的認(rèn)知也不甚清楚。特別是迄今未建立起穩(wěn)定的雨生紅球藻遺傳改造技術(shù)[19]。因此很難通過同源重組或基因編輯的方法來實(shí)現(xiàn)多基因的引入,獲得雨生紅球藻葡萄糖異養(yǎng)株。相反,如果能夠?qū)⒕哂型耆峭媚芰Φ奈⑸?藻)細(xì)胞與雨生紅球藻進(jìn)行細(xì)胞融合雜交,有可能使葡萄糖利用的重要或全部基因得以在融合子中表達(dá),從而獲得可利用葡萄糖的雨生紅球藻表型。

在水生浮游綠藻類群中,存在著能夠高效利用葡萄糖進(jìn)行快速異養(yǎng)生長的物種[20],其中異養(yǎng)小球藻最為典型。蛋白核小球藻利用葡萄糖異養(yǎng)發(fā)酵,其細(xì)胞密度可在5 d內(nèi)達(dá)到100 g/L的高密度。雨生紅球藻與小球藻同屬于綠藻門,具有一定的親緣關(guān)系,因此本研究擬通過原生質(zhì)體融合的方式進(jìn)行雨生紅球藻和小球藻間的種間雜交,并通過限制性的糖異養(yǎng)條件篩選具有糖異養(yǎng)生長能力的融合子細(xì)胞,該研究的開展有可能為雨生紅球藻以及其它產(chǎn)業(yè)化微藻的遺傳改良與異養(yǎng)代謝應(yīng)用提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻HaematococcuspluvialisSCCAP K-0084、NIES144、SAG34-1b 分別購自于丹麥哥本哈根大學(xué)SCCAP藻類與原生動(dòng)物保藏庫、日本NIES微生物菌種庫和德國SAG藻種保藏庫;小球藻ChlorellakessleriSAG 211-11a、ChlorellapyrenoidosaFACHB29、Chlorellasp. FACHB31 分別購自于德國SAG藻種保藏庫和中國科學(xué)院淡水藻種庫(FACHB);藻種通過BG11培養(yǎng)基[21]進(jìn)行傳代培養(yǎng);D-葡萄糖、D-果糖、乙酸鈉、丙三醇、D-蘋果酸、丁二酸、α-酮戊二酸和檸檬酸 分析純,國藥;酵母提取物 分析純,OXOID;二氯苯基二甲脲(DCMU)分析純,Sigma-Aldrich;2-脫氧-d-葡萄糖(2DG) 99%試劑純,上海生工;蛋白酶K(40 U/mg)、纖維素酶(500 U/mg)、半纖維素酶(200 U/mg) 分子生物學(xué)級(jí),索萊寶;葡萄糖醛酸酶(1 kU/mg) Sigma-Aldrich。

PGX-250C光照培養(yǎng)箱 寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;BX53顯微鏡 日本Olympus公司;SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;HWS-12恒溫水浴 上海一恒科技公司;WD-9405A水平搖床 北京市六一儀器廠

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可利用糖底物的篩選與潮霉素抗性鑒定 基于BG11培養(yǎng)基,在其中添加10 μmol/L光合抑制劑二氯苯基二甲脲(DCMU)抑制光合作用,同時(shí)分別添加2 g/L的D-葡萄糖、D-果糖、乙酸鈉、丙三醇、D-蘋果酸、丁二酸、α-酮戊二酸或檸檬酸作為碳源底物,培養(yǎng)基中添加1.5 g/L瓊脂制備固體平板。培養(yǎng)中分別將三種雨生紅球藻和三種小球藻細(xì)胞涂布于平板上,(25±1) ℃暗處培養(yǎng),根據(jù)克隆的出現(xiàn)與否判斷底物的可利用性。對于細(xì)胞潮霉素抗性比較,也是基于BG11培養(yǎng)基,在其中分別添加不同濃度的潮霉素,添加瓊脂制備固體平板,培養(yǎng)中分別將三種雨生紅球藻和三種小球藻細(xì)胞涂布于平板上,(25±1) ℃光照培養(yǎng),根據(jù)克隆生長情況判斷細(xì)胞耐受能力。

1.2.2 雨生紅球藻的原生質(zhì)體制備 雨生紅球藻原生質(zhì)體制備參考Cheng等[22]的方法。將BG11中培養(yǎng)7～10 d的雨生紅球藻細(xì)胞以2×103個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于BYA培養(yǎng)基中,BYA培養(yǎng)基是在BG11基礎(chǔ)上添加2 g/L的乙酸鈉和2 g/L的酵母提取物,培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃,連續(xù)光照強(qiáng)度為(50±1) μmol/(m2·s),每天定時(shí)搖動(dòng)3次。3～4 d培養(yǎng)后獲得超過85%的雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞并用于原生質(zhì)體制備。原生質(zhì)體的酶處理采用含有0.06%的蛋白酶K、0.05 mol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2、0.2 mol/L山梨醇/甘露醇的酶解液(pH7.8)處理雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞2～3 h。

1.2.3 小球藻的原生質(zhì)體制備 小球藻原生質(zhì)體的制備采用Rosen等[23]的方法。2500×g轉(zhuǎn)速下離心5 min收集培養(yǎng)對數(shù)期的小球藻細(xì)胞,以2-脫氧-d-葡萄糖(2DG)作為預(yù)處理劑,將藻細(xì)胞置于含有1%(w/v)Glu/2DG(1∶3)的BG11中,于39 ℃下預(yù)處理24 h。預(yù)處理后用BG11洗滌藻細(xì)胞,最后將藻細(xì)胞置于含有4%纖維素酶、4%半纖維素酶、5%葡萄糖醛酸酶、8 mmol/L CaCl2、0.3 mol/L山梨醇/甘露醇的酶解液中,控制細(xì)胞密度為2×106～3×106個(gè)/mL,于29 ℃黑暗環(huán)境下酶解24 h。

1.2.4 原生質(zhì)體制備率的計(jì)算 雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞滲透敏感性高,其原生質(zhì)體制備率的計(jì)算采用Cheng等[22]的方法,以胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的去除來統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體釋放效率。ECM的去除是通過顯微觀察并結(jié)合血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)檢測,每個(gè)樣品至少3個(gè)平行,每個(gè)平行至少有200個(gè)細(xì)胞被統(tǒng)計(jì)和分類。酶解前及酶解后無ECM的細(xì)胞比例分別為R0和R1,則ECM去除率(%)=(R1-R0)÷(1-R0)×100。

小球藻原生質(zhì)體制備效率采用Tjahjono等[24]所述的Triton裂解率統(tǒng)計(jì)方法,以0.019% Triton X-100作為原生質(zhì)體裂解劑。將樣品平均分成2份,一份加入Triton X-100使終濃度為0.019%,另一份加入等體積的PBS緩沖液(含0.3 mol/L山梨醇/甘露醇),30 min后分別用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)加入Triton X-100的完整細(xì)胞數(shù)(X1)及加入PBS緩沖液(含0.3 M山梨醇/甘露醇)的完整細(xì)胞數(shù)(X2),則Triton裂解率(Lysis rate)=(X2-X1)÷X2×100%。

1.2.5 雨生紅球藻與小球藻原生質(zhì)體融合 原生質(zhì)體融合采用PEG融合,參考陳波[25]采用的方法。雨生紅球藻與小球藻的原生質(zhì)體酶解后用重懸于含0.3 mol/L山梨醇/甘露醇的高滲緩沖液中,分別按細(xì)胞個(gè)數(shù)1∶10、1∶5和1∶1的混合細(xì)胞懸液,500×g轉(zhuǎn)速下離心3 min,傾去上清液,向沉淀中加入1 mL原生質(zhì)體融合液(40%聚乙二醇6000,添加0.6 mol/L山梨醇/甘露醇和50 mmol/L CaCl2-2H2O),輕輕混勻,于30 ℃水浴保溫30 min后,緩慢加入1 mL原生質(zhì)體清洗液(pH9.0的50 mmol/L甘氨酸緩沖液,添加0.6 mol/L山梨醇/甘露醇和50 mmol/L CaCl2-2H2O),輕輕混勻,10 min后再加入2 mL清洗液(對照組每次加入同等體積的原生質(zhì)體培養(yǎng)液)。10 min后再加入2 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)液(BG11培養(yǎng)基添加0.3 mol/L山梨醇/甘露醇),離心洗滌,再用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心洗滌3次,得到雨生紅球藻與小球藻原生質(zhì)體融合產(chǎn)物。

1.2.6 融合細(xì)胞的篩選 融合細(xì)胞在原生質(zhì)體培養(yǎng)液中經(jīng)過暗處48 h恢復(fù)性培養(yǎng),在限制性糖異養(yǎng)平板條件進(jìn)行篩選,篩選培養(yǎng)基BG11為基礎(chǔ),添加10 μmol/L光合抑制劑二氯苯基二甲脲(DCMU)和4 g/L葡萄糖(glu)去除野生型雨生紅球藻細(xì)胞,同時(shí)添加10 μg/mL的潮霉素(hyg)抑制小球藻細(xì)胞的繁殖,加入1.5 g/L瓊脂以制備固體平板。融合后的細(xì)胞經(jīng)過24 h的恢復(fù)性培養(yǎng)后,每103個(gè)雨生紅球藻形態(tài)細(xì)胞被均勻涂布在一個(gè)固體平板上,平板置于25 ℃培養(yǎng)3～4周。

1.2.7 融合子在含葡萄糖培養(yǎng)基中生長速率的測定 挑選3株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后未產(chǎn)生形態(tài)分化的融合子以及另外兩個(gè)親本藻株,于BG11+4 g/L Glu的培養(yǎng)基中培養(yǎng),接種密度控制在103個(gè)/mL,于散射光處25 ℃培養(yǎng)10 d,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)[22]對比生長差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)在EXCEL中進(jìn)行記錄與方差計(jì)算分析,并在SigmaPlot中作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻與小球藻的異養(yǎng)生長

DCMU是一種光合抑制劑及光形態(tài)建成抑制劑,它能抑制從PSⅡ上的Q向PQ的電子傳遞,研究中使用10 μmol/L的DCMU添加能夠有效地抑制小球藻和雨生紅球藻的光合自養(yǎng)生長。對比了3種小球藻和3種雨生紅球藻基于不同碳源底物的異養(yǎng)生長能力,結(jié)果如表1中所示。3種小球藻均能夠利用葡萄糖、果糖和乙酸鈉進(jìn)行異養(yǎng)生長,相比而言C.kessleriSAG211.11a的異養(yǎng)生長能力更強(qiáng),同時(shí)還可以利用甘油、蘋果酸以及琥珀酸進(jìn)行異養(yǎng)生長。小球藻是目前報(bào)道最多的能夠利用不同碳源底物進(jìn)行異養(yǎng)生長的真核微藻類群[26],大量的報(bào)道也表明雨生紅球藻僅可以利用乙酸鹽進(jìn)行異養(yǎng)生長[9-10],本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)3種雨生紅球藻均只能利用乙酸鈉進(jìn)行異養(yǎng)生長,在其它底物下細(xì)胞完全不能分裂和繁殖。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)H.pluvialisK0084藻株具有較強(qiáng)的潮霉素耐受能力(如圖1),在10 μg/mL潮霉素濃度下H.pluvialisK0084能夠在平板上正常形成藻落,而C.kessleriSAG211.11a的生長則受到明顯抑制,這使得研究中可以通過限制性糖異養(yǎng)條件和潮霉素的添加來分別抑制野生型雨生紅球藻和小球藻的生長,非常適合于融合子的篩選過程。因此,本研究選用H.pluvialisK0084和C.kessleriSAG211.11a進(jìn)行細(xì)胞間的原生質(zhì)體融合研究。

表1 不同碳源底物下雨生紅球藻和小球藻的異養(yǎng)生長能力Table 1 Heterotrophic growth of Haematococcus and Chlorella species based on different carbon resources

圖1 不同濃度潮霉素對H.pluvialis K0084和C.kessleri SAG211.11a的抑制Fig.1 Inhibition of different concentration of hygromycin on H.pluvialis K0084 and C.kessleri SAG211.11a注:hy10、hy20、hy30分別代表潮霉素濃度10、20、30 μg/mL。

2.2 雨生紅球藻的原生質(zhì)體制備

有研究曾提出,雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞不具有纖維素化的細(xì)胞壁,原生質(zhì)體外僅有松散的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)結(jié)構(gòu)包裹,因而在低滲透壓條件下極易裂解,因此不能使用傳統(tǒng)的滲透壓裂解來評(píng)價(jià)原生質(zhì)體得率,并且提出通過利用ECM去除率來衡量原生質(zhì)體的制備效率[22,27]。表1的結(jié)果顯示,雨生紅球藻游動(dòng)細(xì)胞經(jīng)過蛋白酶處理后,無ECM細(xì)胞比例可以提高到75%以上,ECM去除率平均可達(dá)72.11%±3.94%,這表明經(jīng)過酶處理后超過70%的雨生紅球藻細(xì)胞以原生質(zhì)體形態(tài)存在,滿足本研究的需要。

表2 雨生紅球藻原生質(zhì)體制備效率(%)Table 2 Protoplast preparation rate of H. pluvialis(%)

2.3 小球藻原生質(zhì)體的制備

小球藻不同于雨生紅球藻,其不存在明顯的細(xì)胞分化,而且細(xì)胞上有明顯的纖維素化細(xì)胞壁包裹,因而小球藻的原生質(zhì)體制備大多以纖維素酶和半纖維素酶等多糖降解酶為主,此外為了提高原生質(zhì)體釋放效率,以2-脫氧-d-葡萄糖(2DG)作為預(yù)處理劑處理24 h[28]。如表3所示,本研究中酶解處理后Triton裂解率達(dá)到42.07%±3.73%,這意味著經(jīng)過酶處理后僅有40%左右的小球藻細(xì)胞形成裸露的原生質(zhì)體。以往的研究中不同學(xué)者對于小球藻原生質(zhì)體制備情況研究各異,但大部分的原生質(zhì)體制備率都不高于50%[25,28]。這些研究認(rèn)為,小球藻細(xì)胞壁中存在類似次生細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),該部分在酶解過程中較難降解,尤其是一種孢粉素成分的存在導(dǎo)致原生質(zhì)體釋放效率不高[29]。雖然在小球藻中原生質(zhì)制備效率受到目前技術(shù)條件的限制，無法進(jìn)一步提高,但是由于本研究中可以通過添加潮霉素抑制未融合的小球藻細(xì)胞生長,因此這一結(jié)果仍然可以滿足研究需要。

表3 小球藻原生質(zhì)體制備效率Table 3 Protoplast preparation rate of C. kessleri

2.4 雨生紅球藻與小球藻原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體的融合主要有物理和化學(xué)融合兩種方式,以往藻類細(xì)胞融合研究中大部分都采用的是PEG介導(dǎo)的化學(xué)融合的方式,這種方式操作過程簡單,設(shè)備依賴性低,易于操作[25]。在本研究中融合過程首先利用40% PEG處理實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的聚集,之后再加入高鈣、高pH的融合洗滌液促進(jìn)原生質(zhì)體間的融合。由于雨生紅球藻細(xì)胞同小球藻間存在明顯的細(xì)胞個(gè)體大小差異,因而本研究將雨生紅球藻與小球藻分別按1∶1、1∶5和1∶10的細(xì)胞個(gè)數(shù)比例進(jìn)行混合后,再同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞間的融合,以獲取最佳的細(xì)胞融合與篩選條件。在3種融合條件下,雨生紅球藻周圍都會(huì)有小球藻附著,而且均觀察到各種典型的兩兩融合狀態(tài),之間并未存在任何明顯差異。如圖2A中所示,可以觀察到兩種原生質(zhì)體間彼此靠近,同時(shí)未去壁的雨生紅球藻細(xì)胞由于細(xì)胞壁的障礙,阻止了原生質(zhì)體的融合;此外,在融合過程中也經(jīng)常發(fā)生多個(gè)小球藻原生質(zhì)體同單個(gè)雨生紅球藻原生質(zhì)體聚集和靠近的現(xiàn)象(圖2B),這時(shí)一些互相靠近的原生質(zhì)體間隔膜(細(xì)胞膜)逐漸消失,原生質(zhì)體逐漸發(fā)生融合(圖2C)。因此,本過程完全實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻和小球藻間的融合與雜交。

圖2 雨生紅球藻和小球藻間的細(xì)胞融合觀察Fig.2 Micrographs of cell fusion between H.pluvialis and C.kessleri注:A～C均為1∶1融合條件的結(jié)果。

2.5 糖異養(yǎng)細(xì)胞的篩選

以往的原生質(zhì)體融合研究中,通常通過單細(xì)胞顯微操作,將融合細(xì)胞分離后再進(jìn)行表型鑒定與選育,這種方式完全依賴于個(gè)人的操作,能夠篩選和鑒定的融合子克隆數(shù)量非常有限[25],因此本研究采用限制性糖異養(yǎng)條件進(jìn)行篩選,針對整合融合后的細(xì)胞樣品,選育具有糖異養(yǎng)生長能力的雨生紅球藻融合子克隆。由于雨生紅球藻不能利用葡萄糖進(jìn)行異養(yǎng)生長,在添加光合作用抑制劑DCMU的含糖培養(yǎng)基中,野生型無法生長,通過這一條件可以篩選出能夠進(jìn)行糖異養(yǎng)生長的雨生紅球藻融合子細(xì)胞,但由于小球藻可以在這一條件下快速生長,這會(huì)大大影響篩選效率,為此,在該篩選培養(yǎng)條件下還加入了10 μg/mL的潮霉素抑制小球藻的生長。如圖3所示,經(jīng)過3～4周的篩選性培養(yǎng)在雨生紅球藻對照平板上,完全沒有任何藻落形成,經(jīng)過顯微鏡檢觀察,涂布后的細(xì)胞完全被裂解,或者仍然保持單細(xì)胞未分裂增殖狀態(tài),小球藻對照平板上,僅有個(gè)別克隆形成,生長受到潮霉素的抑制。對于1∶1、1∶5和1∶10比例下融合細(xì)胞樣品,隨著小球藻比例的提高,更多的克隆在平板上形成。通過顯微鑒定發(fā)現(xiàn)兩種不同形態(tài)的藻落形成(如圖4),一種是藻落明顯且照片中清晰可見的大部分克隆,經(jīng)過鑒定完全是小球藻形態(tài)細(xì)胞;另一種是較小且照片中不清晰或完全肉眼不可見的克隆,但經(jīng)過顯微觀察確定為正常的雨生紅球藻藻落。通過這種顯微鑒定方式,對各個(gè)融合條件與對照下的平板進(jìn)行了顯微統(tǒng)計(jì),結(jié)果如表4所示,在1∶1融合條件下,平板上獲得的藻落大部分為雨生紅球藻類型,僅有個(gè)別小球藻藻落形成,隨著融合中小球藻細(xì)胞比例的提高,在1∶5與1∶10融合條件下出現(xiàn)越來越多的小球藻形態(tài)的藻落,此外,在1∶10的融合比例下,大量的小球藻落形成,完全沒有鑒定到雨生紅球藻形態(tài)的糖異養(yǎng)克隆,這可能是由于大量小球藻藻落的形成,吸收和利用了大部分平板營養(yǎng),限制了雨生紅球藻融合子繼續(xù)生長,而如果能通過細(xì)胞分選技術(shù)在融合后進(jìn)行融合細(xì)胞與小球藻的高效分離,有可能大大地提高融合細(xì)胞的篩選效率。

圖3 H.pluvialis與C.kessleri不同融合比例下的平板篩選Fig.3 Screening plates from fusion samples with different cell ratios of H.pluvialis and C.kessleri

圖4 融合子篩選性平板上的兩種克隆形態(tài)Fig.4 Two microscopic forms of colonies on the fusant-screening plate注:A：雨生紅球藻形態(tài);B：小球藻形態(tài)。

細(xì)胞比例(Hp∶Ck)總克隆數(shù)H. pluvialis克隆數(shù)Chlorella克隆數(shù)1∶112.3±1.959.3±1.642.9±0.991∶535.13±9.130.25±0.7134.88±9.371∶1086±25.740±086±25.74

2.6 融合子的培養(yǎng)與鑒定

對于融合條件獲得平板,經(jīng)過顯微克隆形態(tài)鑒定后,選取雨生紅球藻形態(tài)的融合子克隆,接種到含有BG11培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng),經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后,將正常生長的克隆轉(zhuǎn)移到50 mL三角瓶中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定觀察。經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后的融合子與野生型親本藻株的細(xì)胞形態(tài)如圖5所示。從顯微照片可以看到,雨生紅球藻融合子細(xì)胞在外觀、大小上與野生型雨生紅球藻類似。另外,還可以觀察到某些融合子培養(yǎng)后,形成了類似小球藻形態(tài)的克隆,但是其逐漸開始分化(圖5D),分化出的細(xì)胞形態(tài)類似小球藻,但比小球藻要大,說明某些融合子在遺傳表型上并不穩(wěn)定。陳波[25]也曾報(bào)道,雨生紅球藻和小球藻的融合子細(xì)胞中可能會(huì)有形態(tài)類似小球藻,但個(gè)體較大的細(xì)胞。本研究統(tǒng)計(jì)了挑選的融合子經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后遺傳表型的分化情況,在所挑選的72個(gè)融合子克隆中,有23個(gè)融合子出現(xiàn)了向小球藻分化的情況,其它融合子經(jīng)兩次以上傳代后遺傳表型仍能夠保持。

圖5 野生型雨生紅球藻(A)、小球藻(B)及融合子細(xì)胞(C,D)顯微照片F(xiàn)ig.5 Micrographs of wild-type H. pluvialis(A),Chlorella(B)and fusants(C,D)。

2.7 融合子的糖異養(yǎng)生長

三個(gè)融合子(Fusant8、Fusant9、Fusant10)被置于含糖條件下進(jìn)行培養(yǎng),它們同雨生紅球藻以及小球藻間的生長差異如圖6所示,三個(gè)融合子的生長速率相比于野生型雨生紅球藻有明顯的增強(qiáng),10 d培養(yǎng)后細(xì)胞密度分別達(dá)到6.7×104、8.7×104和6.5×104個(gè)/mL,明顯高于野生型的2.45×104個(gè)/mL,但是相比于小球藻10 d后1.4×106個(gè)/mL的細(xì)胞密度而言,異養(yǎng)生長能力仍然有限,尚不能滿足高密度培養(yǎng)的需求。目前,細(xì)胞雜交育種技術(shù)在微藻育種中的應(yīng)用研究較少,沈繼紅等[30]曾將富含EPA和DHA的自養(yǎng)綠色巴夫藻和生長迅速的異養(yǎng)四鞭藻用細(xì)胞融合的方法構(gòu)建EPA和DHA高產(chǎn)異養(yǎng)藻株,融合藻株雖較親本異養(yǎng)藻株各方面指標(biāo)大有提高,但相比親本自養(yǎng)藻株仍不夠理想,而且后期遺傳穩(wěn)定性也不高。江勝滔等[31]在酒酵母與雨生紅球藻的細(xì)胞融合子的鑒定過程中認(rèn)為,融合子在世代延續(xù)中可能發(fā)生過雙親DNA的互相排斥或單親DNA的丟失。這可能是造成融合子后代無法獲得穩(wěn)定雜交遺傳表型的主要原因,而如果能夠通過在融合后對融合細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的高強(qiáng)度誘變處理,破除細(xì)胞間的核障礙,有可能使原生質(zhì)體雜交技術(shù)在遠(yuǎn)緣雜交中獲得更廣泛的應(yīng)用。

圖6 三個(gè)雨生紅球藻融合子及親本藻株在含葡萄糖培養(yǎng)基中的生長Fig.6 Growth curve of H.pluvialis fusants and parental strains cultured in medium with glucose

3 結(jié)論

本研究通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合技術(shù),實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻同小球藻間的細(xì)胞雜交,而且基于限制性糖異養(yǎng)條件篩選出具有雨生紅球藻形態(tài)融合子克隆,這些融合子細(xì)胞獲得了增強(qiáng)的糖代謝能力,但是經(jīng)過傳代后會(huì)出現(xiàn)遺傳表型蛻化以及糖異養(yǎng)生長能力低等問題,尚不能滿足細(xì)胞高密度培養(yǎng)的需要。究其原因,應(yīng)該是由于細(xì)胞融合后兩基因組間無法有效實(shí)現(xiàn)同源重組所導(dǎo)致的,而如果能將原生質(zhì)體融合技術(shù)同高強(qiáng)度的基因組誘變技術(shù)相結(jié)合,提高融合后異源基因組間的重組效率,有可能建立更高效的藻種間基因組雜交與選育技術(shù),為雨生紅球藻藻種改良建立更高效的平臺(tái)技術(shù)與體系。