基于蛋白組學(xué)探討石斛合劑對糖尿病大鼠的作用機(jī)制

林心君，秦崇濤，陳 勇，施 紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

糖尿病是以慢性高血糖為其主要特征的代謝性疾病，隨著其發(fā)病率的不斷增加，現(xiàn)已成為全球廣泛關(guān)注的公共健康問題。我國糖尿病患者人數(shù)全球第二，僅次于印度，其中90%以上為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）［1］。 臨床上治療 T2DM 的藥物雖各具特點(diǎn)和優(yōu)勢，但仍不能滿足臨床治療的需求［2-3］。中醫(yī)藥治療糖尿病在我國已有數(shù)千年的歷史，大量研究表明中藥能多組分、多靶點(diǎn)地發(fā)揮治療作用，糾正糖尿病患者機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡，有著標(biāo)本兼顧的優(yōu)勢［4-6］。本課題組多年來通過對T2DM的臨床-基礎(chǔ)的反復(fù)實(shí)踐與修正，形成了具有滋陰益氣活血功效的中藥復(fù)方石斛合劑（專利申請?zhí)枺?01110408411.0）。該方不僅使患者煩渴、燥熱、乏力等癥狀明顯改善，甚至消失，具有穩(wěn)定的降糖、調(diào)脂功效，還能改善糖尿病模型鼠的糖脂代謝，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖和胰島素受體表達(dá)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖代謝［7-10］。糖尿病大鼠肝組織基因表達(dá)譜芯片研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病大鼠與正常大鼠存在的差異基因有1 300多個(gè)，經(jīng)石斛合劑治療后近千個(gè)基因表達(dá)量恢復(fù)正常［11］。而蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是對基因組信息的進(jìn)一步解讀［12］，相對和絕對定量同位素標(biāo)記（isobarictags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)能高通量篩選蛋白質(zhì)，使尋找新的糖尿病藥物治療靶點(diǎn)逐步成為可能，在糖尿病領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［13-14］。我們在建立糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上利用該技術(shù)對大鼠肝臟進(jìn)行蛋白組學(xué)檢測和數(shù)據(jù)信息學(xué)分析，尋找糖尿病大鼠和正常大鼠間的差異蛋白，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級雌性Wistar大鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量180～220 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001，單籠 5只飼養(yǎng)，自由取食和飲水，12 h光照／12 h黑暗，室溫25℃，相對濕度80%?；A(chǔ)飼料配方由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料配方參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)的高脂飼料配方［7］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 石斛合劑1號(hào)方（石斛15 g，黃芪20 g，五味子 8 g，葛根 15 g，生地黃 15 g，丹參 15 g，知母 12 g等）、石斛合劑 2號(hào)方（茵陳 18 g，滑石15 g，扁蓄 15 g，梔子 10 g，大黃 6 g等）購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。上述2方分別經(jīng)浸泡、水煎、水浴鍋蒸發(fā)濃縮至流浸膏，用乙醇提取，濾過，回收乙醇，加水制備成含生藥量2 g／mL的濾液，每瓶100 mL分裝滅菌。二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）用蒸餾水稀釋至含藥量5 g／L，每瓶100 mL分裝。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；iTRAQ試劑（美國SCIEX公司）；質(zhì)譜級胰蛋白酶（美國 Promega公司）；Multifuge X1R型低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司），Triple TOF 5600 質(zhì)譜儀器（AB SCIEX，Concord，ON 美國SCIEX公司）；LC-20AD納升液相色譜儀（日本島津公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型制備 以隨機(jī)數(shù)表法分為正常組10只和造模組30只。正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂高糖飼料，均喂養(yǎng)6周。對造模組大鼠2次腹腔注射STZ（體質(zhì)量＜200 g的大鼠按25 mg／kg注射，體質(zhì)量＞200 g的大鼠聯(lián)合體表面積注射，間隔3 d）。5 d后，尾靜脈取血測血糖，選取連續(xù)2天FBG＞7.0 mmol／L或 PBG＞16.7 mmol／L者為糖尿病模型大鼠，本次造模大鼠全部成模。

2.2 分組和干預(yù) 取成模大鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、石斛合劑組、二甲雙胍組各10只。石斛合劑組先以石斛合劑1號(hào)方按17.2 g／（kg·d）灌胃 7 d，繼以石斛合劑 2 號(hào)方按 12.4 g／（kg·d）灌胃3 d，如此循環(huán)灌胃；二甲雙胍組以二甲雙胍按100 mg／（kg·d） 灌胃；模型組、正常組用等量生理鹽水灌胃，每日上午9時(shí)灌胃，持續(xù)60 d。

2.3 動(dòng)物取材 于末次用藥24 h后進(jìn)行動(dòng)物取材，稱量大鼠體質(zhì)量后以10%烏拉坦麻醉，迅速開腹，取肝組織置于液氮中儲(chǔ)存以行蛋白組學(xué)檢測。每組取3只大鼠，剩余大鼠用于課題組其他實(shí)驗(yàn)。

2.4 iTRAQ檢測肝組織蛋白質(zhì)組學(xué)

2.4.1 蛋白質(zhì)提取和濃度定量 用蛋白裂解液溶解肝臟蛋白質(zhì)樣品，繼而還原打開二硫鍵，以便充分酶解蛋白。采用Bradford法對蛋白進(jìn)行濃度定量，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

2.4.2 蛋白質(zhì)酶解和iTRAQ標(biāo)記 每個(gè)樣品取100 μg蛋白置于離心管中酶解，并按照iTRAQ試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記；等量、充分混勻標(biāo)記后的樣品，離心后備用。

2.4.3 強(qiáng)陽離子交換色譜（SCX）預(yù)分離 將標(biāo)記好的混合肽段復(fù)溶后進(jìn)行梯度洗脫；并根據(jù)峰型和時(shí)間收取梯度組分，除鹽后凍干。繼而行蛋白質(zhì)液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-ESI-MS／MS）分析。最后進(jìn)行納升液相色譜儀分離（每個(gè)組分上樣 5 μL）后采集數(shù)據(jù)。

2.5 生物信息分析 本次使用數(shù)據(jù)庫為IPI（International Protein Index）Rat（39925 sequences）， 并 使用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot 2.3.02軟件進(jìn)行分析。通過生物信息學(xué)分析工具DAVID在線分析對鑒定的蛋白進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能注釋、定位分析及功能富集分析。當(dāng)?shù)鞍棕S度比的差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P＜0.05時(shí)，視為差異蛋白。檢索參數(shù)設(shè)置見表1。

3 結(jié) 果

3.1 質(zhì)譜基本鑒定信息和質(zhì)量評估 通過Mascot軟件進(jìn)行分析，得到總的二級譜圖數(shù)：347 098張，匹配到的譜圖數(shù)量60 622張，共鑒定出iTRAQ標(biāo)記定量信息的肽段15 272個(gè)，特有肽段14 342個(gè)，蛋白3 631個(gè)。我們從圖1中看到，在全掃描范圍內(nèi)絕大部分的離子delta值（即偏差）顯示以0為中心的正態(tài)分布，都集中于±10 ppm之間。

圖1 肽段的質(zhì)量準(zhǔn)確度分布圖

3.2 GO注釋 GO功能注釋具有三級結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)定義，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和蛋白質(zhì)所屬的細(xì)胞組分（cellular component，CC）三個(gè)層次，蛋白質(zhì)所屬的細(xì)胞組分，即亞細(xì)胞定位。見圖2。

3.3 肝臟組織差異蛋白質(zhì)的篩選 本研究利用iTRAQ技術(shù)對各組大鼠肝臟進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，各組大鼠差異蛋白統(tǒng)計(jì)數(shù)量見表2，與糖尿病相關(guān)的差異蛋白見表3。

4 討 論

4.1 iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念由澳大利亞科學(xué)家最先提出［15］，研究技術(shù)從雙向凝膠電泳技術(shù)逐漸發(fā)展至基于質(zhì)譜鑒定的多維液相色譜分離技術(shù)［16］。其中被廣泛應(yīng)用的 iTRAQ技術(shù)是2004年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出的一種全新的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)［17］。該技術(shù)對低豐度蛋白檢測的靈敏度高，蛋白覆蓋率高，在iTRAQ標(biāo)記過程中仍能保留常見的翻譯后修飾位點(diǎn)［18］。以iTRAQ為標(biāo)記的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，是尋找差異表達(dá)蛋白和篩選與疾病相關(guān)的蛋白分子標(biāo)志物的理想工具［19］。本研究共鑒定出iTRAQ標(biāo)記定量信息的肽段15272個(gè)，蛋白3 631個(gè)。我們從離子的質(zhì)量偏差分布圖看出，所測得的肽段質(zhì)量數(shù)穩(wěn)定，偏差小，表明了儀器的準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，對后續(xù)研究提供質(zhì)量保證。

圖2 GO功能注釋圖

表2 各組大鼠差異蛋白統(tǒng)計(jì)數(shù)量

4.2 GO注釋 針對鑒定出的差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋，包括蛋白質(zhì)所屬的細(xì)胞組分（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF）三個(gè)層次，從而確認(rèn)蛋白質(zhì)在哪些分子功能或生物學(xué)過程顯著富集。結(jié)果顯示，在CC層次（圖2A），細(xì)胞（cell）所占百分比最高為19.17%，接著依次是細(xì)胞部分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）、細(xì)胞膜（membrane）、大分子復(fù)合物（macromolecular complex）等，GO功能分析顯示，在細(xì)胞核、胞漿中表達(dá)的差異蛋白質(zhì)所占比重較突出。在BP 層次（圖 2B），細(xì)胞過程（cellular process）所占百分比最高為12.79%，接著依次是代謝過程（metabol-ic process）、單組織過程（single-organism process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）等，揭示差異表達(dá)蛋白大多參與了細(xì)胞代謝過程、初級代謝過程、代謝合成、信號(hào)傳導(dǎo)等。在MF層次（圖2C），參與綁定（binding）功能的差異蛋白所占百分比最高為50.75%，接著依次是催化活性（catalytic activity）、酶調(diào)節(jié)活動(dòng)（enzyme regulator activity）、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)（structural molecule activity）、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活動(dòng)（protein binding transcription factor activity）等，揭示這些蛋白參與酶的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄活性、水解代謝反應(yīng)等功能。

表3 與糖尿病相關(guān)的差異蛋白

4.3 肝臟組織差異蛋白質(zhì) 本研究采用iTRAQ為標(biāo)記的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的新技術(shù)對各組大鼠肝臟進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與正常組相比，模型組差異蛋白161種；與模型組相比，石斛合劑組總差異性蛋白數(shù)量為352種；二甲雙胍組總差異性蛋白數(shù)量為125種。雖然鑒定出的差異蛋白數(shù)量較多，但亦有部分未知功能的蛋白，這里僅討論與糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)的蛋白。

高血糖是導(dǎo)致鐵蛋白增高的主要因素［20］，流行病學(xué)研究提示高鐵蛋白水平和糖尿病的發(fā)生呈正相關(guān)［21］，是糖尿病的危險(xiǎn)因素［22］。 本研究結(jié)果顯示模型組鐵蛋白輕鏈1較正常組升高，這與課題組前期糖尿病大鼠肝臟蛋白芯片的結(jié)果一致［23］，說明糖尿病大鼠鐵代謝異常。而模型組下調(diào)的ApoE是一種主要由肝臟產(chǎn)生的糖基化分泌蛋白，參與脂質(zhì)的運(yùn)輸、儲(chǔ)存及排泄過程，抑制血小板積聚［24］，一旦其構(gòu)象或濃度發(fā)生了變化，將導(dǎo)致血脂代謝異常，進(jìn)而引發(fā)糖尿病，因此 ApoE基因成為糖尿病的常見候選基因之一［25］。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）所含的半胱氨酸能與金屬相結(jié)合，具有強(qiáng)大的自由基清除能力，其亞型MT-Ⅰ／Ⅱ主要分布在肝和腎。MT通過增加葡萄糖利用及能量供應(yīng)，抗氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡來減少糖尿病導(dǎo)致的心臟損傷和腎損傷［26］。本研究中結(jié)果顯示模型組中MT-Ⅰ／Ⅱ明顯下調(diào)，可能與糖尿病及其心、腎并發(fā)癥相關(guān)。

甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MVK）是體內(nèi)膽固醇代謝途徑的重要限速酶［27］，該途徑先以乙酰輔酶A為原料并在MVK的催化作用下最終生成膽固醇、法呢基焦磷酸等。本研究結(jié)果顯示乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、MVK、法呢基焦磷酸合酶在模型組中均出現(xiàn)了上調(diào)，提示甲羥戊酸途徑被激活，說明糖尿病大鼠肝臟的脂代謝活躍。

脂肪酸結(jié)合蛋白廣泛存在于機(jī)體多種組織內(nèi)，包括脂肪細(xì)胞型、表皮型、心肌型、肝臟型等，具有介導(dǎo)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)膽固醇代謝的功能，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［28］，并參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其表達(dá)水平影響多種肝臟病變，被認(rèn)為可成為肝損傷的監(jiān)測指標(biāo)［29］。 Yeung 等［30］研究發(fā)現(xiàn)表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白與血肌酐、腎小球?yàn)V過率呈顯著相關(guān)，并有可能是預(yù)測糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究中模型組上調(diào)的表皮型和心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白除了影響糖尿病大鼠糖脂代謝以外，可能與糖尿病肝腎并發(fā)癥相關(guān)。

蛋白的泛素化修飾過程失調(diào)在癌癥、代謝綜合征等疾病中發(fā)揮重要作用。泛素化因子E4B能將泛素鏈信號(hào)由非降解型轉(zhuǎn)換為可降解型，以促進(jìn)修飾底物的降解［31］。本研究結(jié)果顯示模型組E4B下調(diào)，推測糖尿病模型大鼠出現(xiàn)泛素化修飾過程異常。組蛋白H2A的泛素化修飾參與了DNA損傷修復(fù)［32］，對維持基因組的穩(wěn)定性有重要意義，本研究結(jié)果中模型組的組蛋白H2A相關(guān)基因（histone H2A.Z）表達(dá)降低，使其不能及時(shí)參與DNA損傷修復(fù)過程，可能與大鼠糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)。

原肌球蛋白是一種細(xì)肌絲相關(guān)蛋白，其表達(dá)量下降可以使細(xì)胞骨架重組，形態(tài)發(fā)生變化，參與纖維化和癌癥等疾病進(jìn)程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［33］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠原肌球蛋白α-1鏈異構(gòu)體H、原肌球蛋白α-4鏈在模型組均出現(xiàn)下調(diào)，推測可能與糖尿病肝纖維化進(jìn)程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。這些肝細(xì)胞骨架蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白的改變可導(dǎo)致肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，繼而引起肝損傷甚至腫瘤。

這些模型組較正常組上調(diào)或下調(diào)的蛋白涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量代謝-電子傳遞、翻譯的調(diào)控及翻譯后修飾、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、脂肪酸氧化等方面，說明糖尿病模型大鼠存在著諸多代謝紊亂，這些差異蛋白直接或間接地影響糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。經(jīng)石斛合劑和二甲雙胍治療后，模型組上調(diào)和下調(diào)的部分蛋白出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，如石斛合劑治療后，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、等下調(diào)，而ApoE、原肌球蛋白 α-1鏈異構(gòu)體H等上調(diào)；二甲雙胍治療后乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸結(jié)合蛋白等下調(diào)，而金屬硫蛋白1、組蛋白、泛素化因子E4B等上調(diào)。由此可見經(jīng)石斛合劑組和二甲雙胍組治療后趨向恢復(fù)的蛋白種類存在不同，這表明中藥復(fù)方石斛合劑與西藥二甲雙胍對糖尿病大鼠的靶蛋白的影響不一樣。由于糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病變累及全身多系統(tǒng)多器官，質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)復(fù)雜度高，后續(xù)研究將進(jìn)一步結(jié)合信號(hào)通路進(jìn)一步探討糖尿病的分子機(jī)制，為石斛合劑的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。