基于液質(zhì)聯(lián)用的川芎嗪對人THP-1細(xì)胞干預(yù)作用的代謝組學(xué)研究

李續(xù)博，姜廣宇，董 航，趙 旭*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦外科，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，黑龍江 佳木斯 154002）

急性髓系白血?。╝cute myeloidleukemia，AML）的發(fā)生與患者體內(nèi)造血干細(xì)胞的惡性克隆導(dǎo)致早期原始細(xì)胞大量增殖，分化凋亡障礙有關(guān)。目前，臨床上預(yù)防和治療髓外白血病的方法主要是加大化療劑量或聯(lián)合放療，作用機(jī)理是使化療藥物透過血腦屏障、血睪屏障直接殺傷腫瘤細(xì)胞，但其毒副作用突出，嚴(yán)重影響腫瘤患者的生存質(zhì)量。從白血病細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)理方面考慮，尋找抑制其浸潤轉(zhuǎn)移的藥物是目前研究的熱點(diǎn)。已有研究報(bào)道，川芎嗪具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、化療增效與減毒、放射增敏與放射保護(hù)以及調(diào)節(jié)免疫等作用[1-4]。

我國傳統(tǒng)中藥川芎嗪具有多方面的抗腫瘤活性，這是眾多化療藥物所不能及的，新近研究表明川芎嗪可以抑制實(shí)體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，且已有研究結(jié)果已經(jīng)證明川芎嗪可以有效的抑制HL-60 細(xì)胞的粘附和侵襲能力[5-13]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)技術(shù)靶向探究人THP-1 細(xì)胞的代謝機(jī)制，明確核心靶標(biāo)。同時(shí)基于代謝水平評價(jià)川芎嗪的藥效，為揭示急性髓系白血病的發(fā)病機(jī)制和川芎嗪的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Q-Exactive 超高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo 公司）；XS104 /204/205DU 分析天平（美國梅特勒-托利多）；MPC-P25 微孔板迷你離心機(jī)（中國奧盛儀器有限公司）；MIX-2500 迷你混合儀（中國佑寧儀器有限公司）；測定儀臺式快速離心濃縮干燥器（中國亞歐德鵬科技有限公司）；25 cm2斜頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶（中國信裕生物科技有限公司）；Biosafer-40TD 純水機(jī)（中國賽飛公司）。胎牛血清、McCoy's 5A 液體培養(yǎng)基、DMEM（中國聯(lián)碩生物科技有限公司）高糖培養(yǎng)液。THP-1 細(xì)胞（上海紀(jì)寧JN-B1139），川芎嗪（赫澎生物上?？萍加邢薰?0161025）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞采用McCoy's 5A 培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)傳代。將THP-1 細(xì)胞以每孔2×106接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將6 孔板細(xì)胞分為空白組（加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液），川芎嗪組（加入含川芎嗪濃度2.5 μg/L 培養(yǎng)液1 mL），實(shí)驗(yàn)組每組各重復(fù)6 個(gè)平行孔。

1.3 細(xì)胞提取方法 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，以生理鹽水清洗細(xì)胞3 遍，液氮淬滅后加入1.5 mL的甲醇-水（4：1，v/v）溶液，細(xì)胞刮刀取下細(xì)胞，并置入1.5 mL 離心管中渦旋，超聲破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎后離心（4℃、4 000 r/min、15 min）。取上清液氮?dú)獯蹈桑?00 μL 的0.1%甲酸復(fù)溶。

1.4 分析條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（Waters集團(tuán)公司，美國）；流動相：A 為0.13%甲酸-水，B 為0.1%甲酸-乙腈；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL；梯度洗脫方法見表1。離子噴霧電壓：5.5KV；離子源溫度：600 ℃；解簇電壓（DP）：100V；碰撞能量（CE）：35 eV。氮?dú)鉃殪F化氣和輔助氣：霧化氣55 psi，輔助氣55 psi，氣簾氣35 psi。m/z 在100 ～1200 amu 質(zhì)量范圍進(jìn)行全掃描，積累時(shí)間250 ms。IDA 采用標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)分析物，超過100 cps 的8 個(gè)最強(qiáng)的碎片離子在100 ～1200 amu 質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行子離子掃描，累積時(shí)間為100 ms。碰撞電壓差為15 eV，動態(tài)背景扣除DBS 開啟。自動校準(zhǔn)系統(tǒng)（CDS）對MS 和MS/MS 自動進(jìn)行調(diào)節(jié)和校正。

表1 大鼠尿液樣品UPLC 流動相梯度洗脫方法

1.5 數(shù)據(jù)處理及生物標(biāo)記物鑒定 原始數(shù)據(jù)通過代謝組學(xué)權(quán)威在線分析系統(tǒng)XCMS-Online 進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，之后將包含質(zhì)合比、強(qiáng)度、保留時(shí)間的數(shù)據(jù)包導(dǎo)入SIMCA 11.5 用于模式識別，結(jié)合偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）結(jié)果對分組貢獻(xiàn)率大的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物。最終通過Metline（http://metlin.scripps.edu）、HMDB（http://www.hmdb.ca）、KEGG（https://www.kegg.jp）等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和比對以鑒定生物標(biāo)記物。

2 結(jié)果

2.1 代謝組學(xué)研究 通過降維處理得到影響代謝分布的主成分分析示意圖，由圖1可知，空白組、模型組和給藥組的組內(nèi)聚類良好，組間分離明顯?？瞻捉M和模型組組間分離明顯，證明2組細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有極大差異，可能由于人THP-1 細(xì)胞的異常代謝導(dǎo)致，經(jīng)川芎嗪治療后呈部分回調(diào)趨勢，處于空白組和模型組之間，通過代謝分布可知川芎嗪對人THP-1 細(xì)胞有很好的治療作用；經(jīng)OPLS-DA 篩選空白組和模型組組間對分組具有顯著性貢獻(xiàn)的小分子代謝產(chǎn)物作為潛在生物標(biāo)記物，共鑒定6 個(gè)潛在生物標(biāo)記物（表2），并根據(jù)構(gòu)建代謝通路圖（圖2）及代謝通路分析（表3）。

圖1 人THP-1 細(xì)胞主成分得分圖

圖2 人THP-1 細(xì)胞代謝通路圖

表2 人白血病THP-1 細(xì)胞生物標(biāo)記物

表3 人白血病THP-1 細(xì)胞代謝通路分析

3 討論

苯丙氨酸是所有哺乳動物的必需氨基酸，其膳食攝入量對蛋白質(zhì)生物合成至關(guān)重要。苯丙氨酸可以通過羥基化代謝成酪氨酸。我們的結(jié)果顯示，人THP-1細(xì)胞的苯丙氨酸和酪氨酸的水平顯著高于空白組；苯丙氨酸的水平遠(yuǎn)大于酪氨酸。這意味著在癌癥負(fù)荷下，來自宿主的蛋白質(zhì)的降解也得到增強(qiáng)，這是由顯著降低的血清白蛋白水平所支持的，以產(chǎn)生糖異生和分解代謝所需的氨基酸來供給TCA 循環(huán)。

谷氨酰胺不是一種必需氨基酸，但具有多種生理功能。它是體內(nèi)的氮載體，是快速增殖的細(xì)胞主要燃料來源，如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。谷氨酰胺可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖作為能源，也可用于嘌呤和嘧啶的生物合成，作為DNA 和RNA 生物合成的構(gòu)建塊。在正常狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺保持在一個(gè)相當(dāng)恒定的水平。在癌癥患者中，快速增殖的腫瘤細(xì)胞是谷氨酰胺的主要消耗者，并且隨著疾病的進(jìn)展，宿主血液中谷氨酰胺逐漸耗盡。本次研究發(fā)現(xiàn)人THP-1 細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量下降與先前對其他類型癌癥的觀察結(jié)果一致。

膽堿在與細(xì)胞膜相關(guān)的磷脂代謝中起著重要的作用，并且在腫瘤細(xì)胞體外和體內(nèi)NMR 研究中發(fā)現(xiàn)磷酸膽堿的升高以及總膽堿含代謝物升高。這被認(rèn)為是癌癥中膽堿磷脂代謝異常的一個(gè)特征。在這項(xiàng)研究中觀察到的胞內(nèi)膽堿的低水平可能是由于白血病細(xì)胞增殖過程中膽堿及其衍生物的過度需求所致。

本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)全局分析人THP-1 細(xì)胞的代謝，通過模式分析獲得6 個(gè)生物標(biāo)記物可能與急性髓系白血病的發(fā)病密切相關(guān)，可為臨床診斷及急性髓系白血病的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。