巴西橡膠樹HbHsfA4a的克隆及其對低溫脅迫的響應(yīng)

余文才 李言 吳紹華 晁金全 張世鑫 楊署光 田維敏

摘? 要? 熱激轉(zhuǎn)錄因子（Hsf）是植物響應(yīng)非生物脅迫的重要調(diào)節(jié)因子。本研究利用RT-PCR技術(shù)從橡膠樹93-114葉片中克隆到一個Hsf轉(zhuǎn)錄因子，命名為HbHsfA4a。該基因開放閱讀框為1215 bp，編碼404個氨基酸，其蛋白質(zhì)分子量為46.40 ku，等電點為4.91。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，低溫（4 ℃）脅迫下HbHsfA4a在抗寒性強的橡膠樹無性系93-114樹皮中受低溫誘導(dǎo)大幅上調(diào)表達(dá)，而且顯著高于抗寒性弱的橡膠樹無性系熱墾501。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，HbHsfA4a在抗寒性強的2個橡膠樹無性系中的本底表達(dá)量和低溫脅迫8 h內(nèi)的表達(dá)量均顯著高于抗寒性弱的2個橡膠樹無性系。HbHsfA4a基因可能在橡膠樹應(yīng)對低溫脅迫中起著重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞? 巴西橡膠樹;熱激轉(zhuǎn)錄因子;克隆;低溫脅迫;表達(dá)分析中圖分類號? S794.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

Abstract? Heat shock transcription factors （Hsfs） play an important role in the response of plants to abiotic stresses. An Hsf gene， designated as HbHsfA4a， was cloned from a rubber tree （Hevea brasiliensis） clonal line 93-114 by RT-PCR. The ORF of HbHsfA4a was 1215 bp in length which would encode 404 amino acid residues. The putative protein was predicted to possess a molecular mass of 46.40 ku and an isoelectric point of 4.91. Quantitative Real-time PCR （QRT-PCR） analysis showed that the expression of HbHsfA4a was highly induced in the bark tissue of 93-114 by cold stress （4 ℃） and significantly higher than in Reken501 under the same cold treatment. Further analysis showed that the level of the background expression and the expression of HbHsfA4a in response to cold stress within 8 h in the bark tissue of the two cold-tolerant rubber tree clones was significantly higher than that of the two cold-sensitive rubber tree clones. The up-regulation of HbHsfA4a might be crucial to the survival of rubber trees under cold stress.

Keywords? Hevea brasiliensis Muell. Arg; heat shock transcription factors; cloning; cold stress; expression analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.010

植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常會遭遇各種生物脅迫（如蟲害等）和非生物脅迫（高溫、低溫、干旱、高鹽等）。為了維持生長，適應(yīng)各種不利的環(huán)境條件，植物已經(jīng)形成一系列復(fù)雜而有效的防御策略[1]，其中熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factors， Hsfs）能夠特異性結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的熱激元件（HSE），在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物抗逆性[2-4]。熱激轉(zhuǎn)錄因子是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的末端組分，通過調(diào)節(jié)下游基因活性響應(yīng)高溫脅迫和其他非生物脅迫[5-6]，在生物體的逆境脅迫中起著重要的調(diào)控作用[7-8]。目前，已逐漸揭示了Hsf轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對非生物脅迫中作用。早在2002年，Mishra等[9]就發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)SlHsfA1番茄植株的耐熱性較野生型有顯著提高。過表達(dá)TaHsfA6f的小麥植株能夠改善其耐熱性[10]。在擬南芥中異源表達(dá)番茄SIHsfA3和小麥TaHsf3，可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，OsHSFA2e增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽脅迫的耐受性[13]。向日葵HaHSFA4a和HaHSFAA9在轉(zhuǎn)基因煙草中的共過量表達(dá)對幼苗嚴(yán)重脫水和氧化應(yīng)激的耐受性產(chǎn)生協(xié)同作用[14]。植物Hsf在低溫脅迫中同樣發(fā)揮著重要作用。在低溫脅迫下，水稻A類中的OsHsfA3、OsHsfA4d、OsHsfA7、OsHsfA9熱激轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著增強[15]。4 ℃低溫下小麥TaHsf3過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥存活率提高，表明TaHsf3可能是參與小麥低溫響應(yīng)調(diào)控的關(guān)鍵成員[12]。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)南美洲亞馬遜河流域，是典型的熱帶雨林樹種[16-17]。我國植膠區(qū)位于熱帶北緣，屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，橡膠樹經(jīng)常遭受寒害，嚴(yán)重影響了橡膠樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。鑒于此，從橡膠樹中挖掘抗寒相關(guān)基因，分析其結(jié)構(gòu)特征，闡明其在橡膠樹遭受低溫逆境時的表達(dá)特征，對其功能機制研究提供重要的理論依據(jù)。前期對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一條Hsf在不同抗寒性種質(zhì)中差異表達(dá)。為了深入研究該基因的功能，本研究采用RT-PCR技術(shù)從橡膠樹葉片中成功克隆獲得該基因，并分析了其編碼蛋白序列結(jié)構(gòu)特征及進(jìn)化關(guān)系，同時利用qRT-PCR分析該基因在抗寒性有明顯差異的橡膠樹種質(zhì)應(yīng)對低溫脅迫時的表達(dá)模式，為進(jìn)一步解析HbHsfA4a的生物學(xué)功能及調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1 植物材料? 以橡膠樹抗寒性強的93- 114[17-18]、GT1[17-18]、湛試327-13[19-20]和抗寒性弱的熱墾501[21-22]、海墾1[18]、熱墾515[23]一篷葉穩(wěn)定期芽接苗作為供試材料，進(jìn)行低溫脅迫處理。以種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠種植圃未開割的橡膠樹無性系93-114為供試材料，進(jìn)行基因克隆。

1.1.2? 試劑? 本實驗所用植物總RNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司;pEASY-Blunt Simple Cloning Kit和Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)購自北京全式金生物科技有限公司;qRT-PCR熒光染料TB Green? Premix Ex Taq?II購自TaKaRa公司。

1.2? 方法

1.2.1? 材料處理? 選取處于一蓬葉穩(wěn)定期長勢一致的93-114、GT1、湛試327-13、熱墾501、海墾1和熱墾515幼苗，28 ℃培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理， 每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)5株幼苗，處理0、4、8、24 h后， 采集離葉蓬10 cm處莖樹皮，5株樣混合后液氮速凍，提取RNA。

1.2.2? RNA提取及反轉(zhuǎn)錄? 將上述采集到的樣品液氮磨樣，以天根生化科技有限公司的RNA prepPur多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取各樣品總RNA，使用DNase I（天根生化科技有限公司）去除RNA中的DNA。利用Thermo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermo RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，cDNA產(chǎn)物于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? HbHsfA4a基因的克隆? 從課題組前期構(gòu)建的巴西橡膠樹低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，挖掘到一條Hsf轉(zhuǎn)錄因子，通過在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫中比對搜索，獲得其參考序列。依據(jù)參考序列設(shè)計特異性擴增引物（F：5′-TGAATCTTGGAGACTATTGATGTTG-3′;R：5′-CACCAATAGCCCAAAAAGACAAT-3′）進(jìn)行PCR擴增。擴增體系為50 μL，含PrimeSTAR Max Primix（2?） 25 μL、10 μmol/L Forward primer 1μL、10 μmol/L Reverse primer 1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 22 μL。擴增程序為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min;35個循環(huán)后再72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的片段并回收、純化，然后克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Vctor載體上。用載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，培養(yǎng)后挑取陽性菌株送往上海英濰捷基公司測序。

1.2.4? 生物信息學(xué)分析? 利用在線網(wǎng)站EXPASY中的ProtParam工具對基因的氨基酸組成、疏水性、等電點等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。在線網(wǎng)站EXPASY中的ProtScale工具預(yù)測該蛋白質(zhì)的疏水性/親水性;利用SIGNAIP 3.0 Server在線軟件對該蛋白信號肽預(yù)測;TMHMM Server V 2.0在線軟件進(jìn)行蛋白跨膜螺旋預(yù)測。通過PSORT在線軟件對該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測;NCBI中的CD Search分析工具、SMART和MEME軟件分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。SOPMA在線軟件預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載其他植物的HsfA4a蛋白序列，首先用Clustal W進(jìn)行序列多重比對，再利用MEGA 4.0軟件，選擇neighbour- joining（NJ）模型， 并進(jìn)行1000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5? HbHsfA4a基因的表達(dá)分析? 根據(jù)基因序列設(shè)計實時熒光定量特異引物（F：5′-CTGAAAGCCCAGCCATCTCT-3′;R：5′-GGGGATCAGGCTCTGGAACT-3′），內(nèi)參基因為橡膠樹HbActin7a（F：5′-GGCACTTTGGTACTCAAGTC- 3′;R：5′-GAAGCATCCCAATCACTCTC-3′）。取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，稀釋10倍后作為實時定量PCR分析的模板。反應(yīng)采用10 μL體系：SYBR Premix Ex TaqII 5 μL、10 μmol/L Forward primer 0.3 μL、10 μmol/L Re-verse primer 0.3 μL、1st strand cDNA 1 μL和ddH2O 3.4 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCT方法計算基因相對的表達(dá)量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? HbHsfA4a基因的克隆及分析

克隆獲得開放閱讀框為1215 bp，編碼404個氨基酸殘基，根據(jù)其與擬南芥Hsfs基因的同源性將其命名為HbHsfA4a（NCBI 序列號：XM_021804017）。該基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約46.40 ku，理論等電點為4.91，共包含6389原子，分子式為C2009H3131N579O652S18;組成該蛋白的氨基酸中，絲氨酸（Ser）所占比例最高，為9.7%，半胱氨酸（Cys）和酪氨酸（Tyr）所占比例最低，均為0.7%。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為52.03%，屬于不穩(wěn)定類蛋白;親水性平均值為?0.816，屬于親水性蛋白;ProtScale工具預(yù)測該蛋白親/疏水性，結(jié)果顯示HbHsfA4a的氨基酸中親水性氨基酸比例較大，其結(jié)果與EXPASY理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果一致。HbHsfA4a所編碼的蛋白沒有信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞核的概率87.0%。HbHsfA4a二級結(jié)構(gòu)由44.06%α-螺旋、6.68%延伸鏈、3.22%β-轉(zhuǎn)角和46.04%無規(guī)則卷曲組成。

2.2? HbHsfA4a多重序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析

以HbHsfA4a基因推導(dǎo)的氨基酸序列為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索并下載擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_193623）、木薯 （Manihot esculenta，XP_021599108.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002522270.1）、麻瘋樹Jatropha curcas，XP_012091841.1）、胡楊（Populus euphratica，XP_011039379.1）、柚子（Citrus sinensis，XP_006467597.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007025290.1）等8種植物HsfA4a氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與其他植物的HsfA4a蛋白的氨基酸序列的相似性較高，具有植物HsfA亞家族特征的保守結(jié)構(gòu)域。在N端第9～119氨基酸殘基位置含有高度保守的HSF-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，N端第125～202位還有一個保守的寡聚化結(jié)構(gòu)域，在氨基酸序列中部第206～223氨基酸含有核輸入信號（NLS），C端第392～404氨基酸含有核輸出信號（NES），此外C端第329～366、369～385氨基酸有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AHA1和AHA2。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，橡膠樹的HbHsfA4a與木薯MeHsfA4a聚在一組，兩者的遺傳距離最為接近，氨基酸序列相似性為91%。該蛋白與蓖麻的RcHsfA4a、麻風(fēng)樹的JcHsfA4a和胡楊的PeHsfA4a親緣關(guān)系較高，序列相似性分別為86%、83%和78%，與擬南芥的AtHsfA4a序列相似性為60%。

Hsf-DBD：熱激轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域;HR-A/B：寡聚化結(jié)構(gòu)域;NLS：核定位信號;AHA：以芳族、大的疏水和酸性氨基酸為特征的激活結(jié)構(gòu)域;NES：核輸出信號。

2.3? 低溫脅迫對HbHsfA4a基因表達(dá)的影響

低溫脅迫下，HbHsfA4a在抗寒性強的橡膠樹無性系93-114樹皮中受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，并且表達(dá)豐度始終維持在較高的水平，而抗寒性弱的橡膠樹無性系熱墾501中無顯著變化。HbHsfA4a在橡膠樹無性系93-114樹皮中的本底表達(dá)量和在低溫脅迫24 h內(nèi)的表達(dá)量均顯著高于橡膠樹無性系熱墾501。

2.4? 低溫脅迫下HbHsfA4a在抗寒性有明顯差異的種質(zhì)中的表達(dá)

進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，低溫脅迫下HbHsfA4a在GT1和湛試327-13兩個抗寒性強的橡膠樹無性系及海墾1和熱墾515兩個抗寒性弱的橡膠樹無性系樹皮中的表達(dá)模式存在明顯差異。總體上，在GT1和湛試327-13中的表達(dá)呈先升后降的變化趨勢，在海墾1和熱墾515中呈逐漸上升的趨勢。HbHsfA4a基因在2個抗寒性強的橡膠樹無性系樹皮中的本底表達(dá)量和在低溫脅迫4 h和8 h時的表達(dá)量均顯著高于2個抗寒性弱的橡膠樹無性系，24 h時GT1仍高于海墾1和熱墾515，湛試327-13低于海墾1和熱墾515。

3? 討論

植物Hsf基因?qū)儆诙嗷蚣易?，依?jù)其結(jié)構(gòu)可分為3個家族A、B和C。與B類和C類Hsf轉(zhuǎn)錄因子相比，植物A類Hsf轉(zhuǎn)錄因子的特有的基序是C端具有富含芳香族（W、F、Y）、疏水性（L、I、V）和酸性（D、E）氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AHA）[24]。本研究克隆獲得HbHsfA4a基因，開放閱讀框為1215 bp，編碼404個氨基酸。氨基酸序列分析表明，該基因蛋白序列具有典型的HsfA亞家族保守結(jié)構(gòu)域，即在N端含有高度保守的Hsf-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和寡聚化結(jié)構(gòu)域、在氨基酸序列的中部含有核輸入信號（NLS）、C端含有核輸出信號（NES）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AHA）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，HbHsfA4a蛋白與木薯、蓖麻等HsfA4a親緣關(guān)系較近，與擬南芥AtHsfA4a氨基酸序列一致性為60.00%。因此，可以確定該基因為橡膠樹HsfA4a。

目前，對A類Hsfs在逆境脅迫中的作用已有大量深入研究和報道。如擬南芥AtHsfA1a和AtHsfA1b在熱響應(yīng)早期階段調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及熱激蛋白的合成，以減輕高溫對細(xì)胞造成的損害[25];Li等[11]發(fā)現(xiàn)番茄熱激轉(zhuǎn)錄因子SlHsfA3可直接調(diào)控SlHsp26.1-P和SlHsp21.5-ER的表達(dá)，使其表達(dá)量顯著增加，過表達(dá)SlHsfA3的擬南芥植株耐熱性增強并且花期推遲;AtHsfA6a在正常條件下的表達(dá)非常低，但可被NaCl和干旱高度誘導(dǎo)表達(dá)，在種子萌發(fā)和幼苗階段，過表達(dá)AtHsfA6a的植物會增強對鹽和干旱脅迫的耐受性[26]。種子特異性HaHSFA9在煙草中的過表達(dá)賦予了對營養(yǎng)生長期干旱的耐受性[27]。對A類中HsfA4a成員的抗逆功能也有了一定研究，但主要集中在對重金屬耐受性[28-29]、對高光和氧化脅迫反應(yīng)的調(diào)控[30]、對熱激反應(yīng)性[31]及耐鹽性[32]，而對低溫脅迫中的功能研究報道極少。本研究為了探索HbHsfA4a在低溫脅迫下橡膠樹中的作用，利用qPCR分析HbHsfA4a在不同抗寒性種質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示抗寒性強的橡膠樹無性系93-114樹皮中受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，并且表達(dá)豐度始終維持在較高的水平，而抗寒性弱的橡膠樹無性系熱墾501中無顯著變化，暗示著HbHsfA4a可能在橡膠樹抵御低溫脅迫途徑中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抗寒性強的GT1和湛試327-13中受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，且在低溫處理4 h和8 h時的表達(dá)量均顯著高于海墾1和熱墾515兩個抗寒性弱的橡膠樹無性系，24 h時表達(dá)量稍有下降，但仍保持較高水平。Hu等[33]研究草莓Hsf基因家族成員在低溫脅迫應(yīng)答時也發(fā)現(xiàn)FvHsfA4a在4 ℃低溫處理后2～8 h間其表達(dá)量上調(diào)達(dá)10倍。由此可見，HbHsfA4a基因可能在橡膠樹冷響應(yīng)早期階段調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和熱激蛋白的合成，以減輕低溫對細(xì)胞造成傷害。HbHsfA4a基因在低溫逆境應(yīng)答中的功能及調(diào)控機制仍需進(jìn)一步的研究。

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