血清miRNA-1246檢測在早期乳腺癌診斷中的應(yīng)用價值

陳巍，張毓#，田燕妮

1西安市中心醫(yī)院普外科，西安710000

2西北婦女兒童醫(yī)院婦科，西安710000

乳腺癌是中國女性發(fā)病率最高、病死率位居第6的惡性腫瘤[1-2]。近年來隨著中國乳腺癌篩查工作的開展，乳腺癌早期檢出率顯著提高，乳腺癌患者的病死率逐年下降，但每年仍然有約7萬乳腺癌患者死亡，絕大部分死亡的乳腺癌患者為晚期患者，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是其主要的死因之一[3-4]。因此，研究乳腺癌生物標(biāo)志物對提高早期乳腺癌的檢出率，降低乳腺癌患者的病死率意義重大。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的、由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過對其靶基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，參與調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡[5]。近年來的研究表明，乳腺癌患者血清中存在多種異常表達(dá)的miRNA[6-8]，其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并且是潛在的乳腺癌分子標(biāo)志物，可以幫助提高乳腺癌診斷的靈敏度和特異度。miRNA-1246位于人染色體2q31.1上，研究表明，miRNA-1246在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，且其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖及耐藥性有關(guān)[9-11]。本研究分析了112例早期乳腺癌患者和104例乳腺良性病變患者的血清miRNA-1246表達(dá)水平，旨在探討血清miRNA-1246檢測對早期乳腺癌的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年1—12月于西安市中心醫(yī)院就診的早期乳腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18歲；②TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期；③經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為乳腺癌；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②乳腺癌為轉(zhuǎn)移病灶；④合并肝、腎功能障礙；⑤合并嚴(yán)重的心腦血管疾??；⑥合并慢性感染性疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入112例乳腺癌患者，年齡46～72歲，平均（56.3±10.2）歲；Ⅰ期42例，Ⅱ期70例。回顧性分析同期收治的104例乳腺良性病變患者的臨床資料，其中，乳腺纖維增生32例，乳腺纖維瘤29例，乳腺囊腫20例，漿液性乳腺炎23例；患者年齡為45～72歲，平均（56.4±9.5）歲。兩組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清miRNA-1246水平檢測

抽取所有研究對象的清晨靜脈血5～10 ml，加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），600 r/min離心 10 min，收集血清，參照miRNeasy血清/血漿試劑盒（購自德國Qiagen公司）說明書提取RNA。應(yīng)用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Ki（t購自日本Takara公司）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（購自日本Takara公司）和ABI 7500熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀（購自美國Applied Biosystems公司）檢測miRNA-1246的表達(dá)水平。miRNA-1246上游引物為5'-ACACTCCAGCTGGGAATGGATTTTTGG-3'，下游引物為5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；以U6作為內(nèi)參，U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCG-3'。 應(yīng) 用 2-△Ct法（△Ct=CtmiRNA-CtU6）計算miRNA-1246的相對表達(dá)量。

1.3 乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物檢測

抽取所有研究對象的清晨靜脈血5～10 ml，加入EDTA后，600 r/min離心10 min，收集血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清糖類抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3，CA15-3）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析；應(yīng)用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miRNA-1246對早期乳腺癌的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miRNA-1246相對表達(dá)量的比較

qPCR檢測結(jié)果顯示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246相對表達(dá)量為（1.75±0.32），明顯高于乳腺良性病變患者的（1.18±0.30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.324，P＜0.01）。

2.2 血清miRNA-1246與腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性

早期乳腺癌患者的血清CA15-3、CEA、CA125、CA19-9水平分別為（66.87±30.23）、（20.37±14.20）、（55.04±12.38）、（35.92±14.01）U/L。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246水平與血清CA15-3、CEA、CA125和CA19-9水平均呈明顯正相關(guān)（r=0.646、0.573、0.721、0.597，P＜0.01）。

2.3 血清miRNA-1246對早期乳腺癌的診斷價值

miRNA-1246診斷早期乳腺癌的的ROC曲線下面積為 0.783（95%CI：0.670～0.914）。當(dāng)血清miRNA-1246相對表達(dá)量為1.34時，約登指數(shù)最大，此時靈敏度為90.9%，特異度為70.2%。（圖1）

圖1 miRNA-1246診斷早期乳腺癌的ROC曲線

3 討論

乳腺癌是中國女性常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，中國每年新發(fā)乳腺癌患者占全球新發(fā)乳腺癌患者的12.2%，死亡患者占全球乳腺癌死亡患者的9.6%[12]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是乳腺癌患者成功治療和生存的關(guān)鍵，目前磁共振成像、超聲以及乳腺鉬靶成像等乳腺癌篩查手段均存在靈敏度或特異度低的限制，并且檢測價格相對昂貴，不利于廣泛開展[13]。因此，尋找早期乳腺癌生物標(biāo)志物對提高乳腺癌的篩查效率和范圍至關(guān)重要。miRNA是一組小的非編碼RNA，其可通過結(jié)合靶mRNA的3'非翻譯區(qū)和5'非翻譯區(qū)或編碼區(qū)，對靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及人體免疫應(yīng)答和腫瘤內(nèi)部血管生成[5]。由于miRNA在血清、腦脊液及其他各種體液中均表達(dá)，并且能夠長期穩(wěn)定存在，可耐受反復(fù)凍融，是目前腫瘤標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246相對表達(dá)量明顯高于乳腺良性病變患者（P＜0.01）。Kuhlmann等[16]通過微陣列芯片分析53例手術(shù)前和43例化療后卵巢癌患者以及35例健康對照者的血清miRNA-1246表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-1246在手術(shù)前和化療后的表達(dá)水平與卵巢癌患者的臨床治療效果或預(yù)后有關(guān)，是卵巢癌潛在的新型血清學(xué)標(biāo)志物。Zhu等[17]通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析8例乳腺癌患者和8例健康對照者的miRNA-1246表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-1246在乳腺癌患者血清中的表達(dá)水平高于健康對照者，提示miRNA-1246在乳腺癌患者的血清中異常表達(dá)。

在癌變過程中，由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、分泌，直接釋放細(xì)胞組織成分，并以抗原、酶、激素或代謝產(chǎn)物的形式存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)或患者體液中，這類物質(zhì)稱為腫瘤標(biāo)志物。臨床上常通過檢測各項腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平對疾病進(jìn)行診斷和分期，CA15-3、CEA、CA125和CA19-9是臨床上較為常用的腫瘤標(biāo)志物[18]。本研究結(jié)果顯示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246水平與血清CA15-3、CEA、CA125和CA19-9水平均呈明顯正相關(guān)（P＜0.01），提示血清miRNA-1246是早期乳腺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物。本研究結(jié)果還顯示，miRNA-1246診斷早期乳腺癌的ROC曲線下面積為0.783，當(dāng)血清miRNA-1246相對表達(dá)量為1.34時，約登指數(shù)最大，此時靈敏度為90.9%，特異度為70.2%，說明miRNA-1246對早期乳腺癌具有一定的診斷價值。

綜上所述，miRNA-1246在早期乳腺癌患者血清中的表達(dá)水平較高，是診斷早期乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物。