人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞成瘤組織中HSG及WNT/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)△

吳閩付，陶金艷，葛正行

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院研究生院，貴陽(yáng)550021

小細(xì)胞肺癌占肺癌的15%～20%，其惡性程度極高，5年生存率僅為10%～20%[1]。小細(xì)胞肺癌對(duì)化療比較敏感，初治緩解率較高，但極易發(fā)生耐藥，由于小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)高、倍增時(shí)間短的特點(diǎn)，因此多數(shù)患者在確診時(shí)往往已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前，臨床針對(duì)小細(xì)胞肺癌的治療仍不具有靶向性。但已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene，HSG）基因 、WNT/Ca2+信號(hào)通路與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]，但目前針對(duì)其與小細(xì)胞肺癌關(guān)系的研究仍較少。本研究對(duì)小細(xì)胞肺癌中HSG基因及WNT/Ca2+信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在為臨床小細(xì)胞肺癌的基因靶向治療提供理論參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

裸鼠20只，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)，雌雄各10只，年齡為6～8周，體重為18～22 g，購(gòu)自常州卡文實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證書(shū)[SCXK（蘇）2011-0003]。

1.2 試劑與儀器

Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自GenStar-Biosolutions公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，人小細(xì)胞肺癌NCIH446細(xì)胞購(gòu)自齊氏生物科技有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將NCI-H446細(xì)胞靜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行傳代，分別在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取第2代NCI-H446細(xì)胞用于接種。

1.4 裸鼠成瘤

1.4.1 細(xì)胞接種將第2代NCI-H446細(xì)胞制成濃度為1×107/HP的細(xì)胞懸液，在100級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用帶6號(hào)針頭的2.5 ml注射器取1 ml細(xì)胞懸液注射于裸鼠皮下，雙前肢腋下注射約0.2 ml[3-4]。

1.4.2 裸鼠腫瘤組織提取與鑒定接種后5天左右，接種部位表面可見(jiàn)一暗紅色突起腫瘤組織，拖頸處死裸鼠，切開(kāi)腫塊皮膚取出腫塊，將腫瘤組織切成重量為50～100 mg的組織塊，隨機(jī)取腫瘤組織塊于10%中性福爾馬林固定液中固定，將標(biāo)本送于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行病理鑒定。

1.5 HSG、WNT 5 A及WNT11基因表達(dá)水平的檢測(cè)

取50 mg腫瘤組織及50 mg距腫瘤組織1 cm的皮膚組織（癌旁組織），采用液相提取法提取腫瘤組織和癌旁組織總RNA，隨后對(duì)總RNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)其質(zhì)量。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系：4 μl 5×Prime Script Buffe（rfor real time），1 μl Prime Script RT Enzyme Mix I，1 μl Oligo dT Primer（50 μmol/L），1 μl Random 6 mers（100 μmol/L），2 μl cDNA 模 板 ，9 μl Rnase Free ddH2O；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反應(yīng)產(chǎn)物于4℃冰箱保存。按如下方法構(gòu)建PCR反應(yīng)體系：SYBR premix Ex Taq Ⅱ 10 μl，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μl，PCR Reverse Prime（r10 μmol/L）0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA模板2 μl，Rnase Free ddH2O 6 μl。按兩步法設(shè)置反應(yīng)條件：第一步，90℃30 s預(yù)變性，共1個(gè)循環(huán)；第二步，95℃5 s，60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用7500 Software v2.3軟件分析PCR結(jié)果?；虻南鄬?duì)表達(dá)量用ΔΔCt法表示，具體計(jì)算公式：成瘤組基因ΔCt=成瘤組基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；對(duì)照組基因ΔCt=對(duì)照組基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；ΔΔCt值=成瘤組基因ΔCt-對(duì)照組基因ΔCt；倍數(shù)變化采用 2-ΔΔCt表示，2-ΔΔCt＞1表示成瘤組基因表達(dá)水平高于對(duì)照組，2-ΔΔCt＜1表示對(duì)照組基因表達(dá)水平高于成瘤組，2-ΔΔCt=1表示兩組表達(dá)水平一致。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成瘤組織鑒定結(jié)果

20只接種NCI-H446細(xì)胞懸液的裸鼠中，1只裸鼠于操作過(guò)程中死亡，15只裸鼠成功成瘤，成瘤率為78.9%（15/19）。腫瘤組織在蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色下可見(jiàn)小于靜止期小淋巴細(xì)胞大小的腫瘤細(xì)胞，其形態(tài)具有圓形、卵圓形或梭形核，細(xì)胞質(zhì)稀少，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，核仁缺乏或不明顯，細(xì)胞邊界不清，可見(jiàn)核切跡，核分裂數(shù)高（圖1）。成瘤組織病理學(xué)形態(tài)與NCI-H446細(xì)胞腫瘤病理學(xué)形態(tài)大致相同，說(shuō)明造模成功。

圖1 裸鼠成瘤組織的病理切片（HE染色，×200）

2.2 基因擴(kuò)展效率分析

取同一標(biāo)準(zhǔn)HSG、WNT5A、WNT11及β-actin基因的cDNA模板，進(jìn)行1倍、10倍、100倍濃度稀釋?zhuān)謩e在同一擴(kuò)展體系下進(jìn)行基因擴(kuò)展，結(jié)果顯示：HSG、WNT5A、WNT11及β-actin基因的擴(kuò)展效率均為89.25%，r2=0.993；各指標(biāo)均無(wú)引物二聚體以及非特異性擴(kuò)增高峰的出現(xiàn)，引物設(shè)計(jì)合理，特異性較高。

2.3 HSG、WNT 5 A及WNT11基因的表達(dá)水平

以癌旁組織為對(duì)照，成瘤組織中HSG基因的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，為（0.79±0.23），WNT5A、WNT11基因的相對(duì)表達(dá)量明顯增高，分別為（6.62±1.45）、（4.80±1.74），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

HSG基因由中國(guó)學(xué)者陳光慧發(fā)現(xiàn)，其編碼產(chǎn)物HSG/MFN2可以通過(guò)抑制ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。HSG基因定位于人1號(hào)染色體短臂36.22，該區(qū)域易發(fā)生基因突變，出現(xiàn)異位或缺失[5]。相關(guān)研究表明，HSG基因通過(guò)影響線粒體融合度及活動(dòng)性而參與細(xì)胞分化過(guò)程[6]。進(jìn)年來(lái)，HSG基因作為一個(gè)抑癌基因逐漸被人們重視[7]。也有研究證明，HSG基因具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[8]。HSG基因與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[9-11]。本研究結(jié)果顯示，成瘤組織中HSG基因的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織（P＜0.01），表明HSG具有抗腫瘤效應(yīng)，可能為潛在的抑癌基因[12-13]，為小細(xì)胞肺癌的早期治療提供靶點(diǎn)。

WNT/Ca2+信號(hào)通路屬于WNT信號(hào)通路中的非經(jīng)典通路之一，激活該通路的關(guān)鍵蛋白有WNT5A、WNT11，該通路被激活后可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號(hào)成分的激活，以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏著和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。WNT5A在各器官腫瘤發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用，在各系統(tǒng)腫瘤組織中都有較高表達(dá)[14-15]。相關(guān)研究表明，WNT信號(hào)異常激活與拮抗基因SFRP的缺失或啟動(dòng)子的甲基化導(dǎo)致基因沉默或表達(dá)下調(diào)有關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，WNT5A、WNT11在成瘤組織中的表達(dá)水平明顯增高，表明WNT/Ca2+信號(hào)通路在成瘤組織中大量開(kāi)放，并參與成瘤的過(guò)程。

綜上所述，HSG基因表達(dá)水平降低及WNT/Ca2+信號(hào)通路大量開(kāi)放共同作用，可以促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。但本研究因受實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)影響，實(shí)驗(yàn)樣本較小，未進(jìn)行相關(guān)蛋白檢測(cè)，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供有限參考。