高鹽飲食對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟的影響及左旋氨氯地平的作用

夏南，張煥鑫，趙繼先，李波

高血壓是臨床常見的心血管病之一，是由遺傳、環(huán)境等多種危險因素相互作用所致。在影響血壓的諸多因素中，鹽扮演著極其重要的角色，其攝入量與人群血壓水平、高血壓患病率，乃至靶器官損害密切相關(guān)。目前已有學者在人和動物身上證實了高鹽飲食對血壓的影響[1,2]，臨床研究表明，日均鹽攝入量每增加100 mmol，收縮壓可升高10.2 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）。除了對血壓的影響，鹽可作為獨立危險因素對靶器官造成損害[3,4]。高鹽飲食可導致心肌肥厚，增加冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┑陌l(fā)病風險，其對腎臟的影響亦不可小覷。Henry等學者發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可引發(fā)自發(fā)性高血壓大鼠和WKY大鼠的腎纖維化，這些變化與轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的過表達有關(guān)[5]。腎纖維化與高血壓可互為因果，不予以控制將會導致惡性循環(huán)，除了限制鹽攝入量，針對鹽敏感性高血壓的藥物干預也極為重要。鈣離子拮抗劑在治療鹽敏感性高血壓及對靶器官的保護方面已得到廣泛的證實，但其作用機制仍不明確。本研究目的是觀察高鹽飲食對自發(fā)性高血壓大鼠血壓、腎臟的影響，左旋氨氯地平干預的療效及具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組16周齡自發(fā)性高血壓大鼠30只[合格證號SCXK（京）2009-0004]，置于室溫20～22℃、相對濕度40%飼養(yǎng)，顆粒飼料喂養(yǎng)[許可證號SYXK（鄂）2009-0049]，自由飲水。隨機分為3組：正常鹽組（含0.4%NaCl飼料喂養(yǎng)，n=10）、高鹽組（含4%NaCl飼料喂養(yǎng)，n=10）、高鹽+左旋氨氯地平干預組（含4%NaCl飼料喂養(yǎng)+左旋氨氯地平灌胃，n=10），左旋氨氯地平由吉林省天風制藥有限公司提供，劑量為5 mg/（kg·d），每日定時灌胃一次，連續(xù)14周。

1.2 尾動脈收縮壓測量標準尾部測壓法測鼠尾動脈收縮壓（BP 98-A Softron動物無創(chuàng)血壓測量儀）。分別于實驗前、實驗第2、4、6、8、10、12、14周時測量血壓。每只大鼠間隔3 min測量5次，記錄血壓變化＜6 mmHg的三次讀數(shù)，取平均值作為大鼠血壓值。

1.3 取材及腎臟指標檢測大鼠16周時斷頭處死，取出雙側(cè)腎臟去除腎被膜后用生理鹽水清洗干凈，置于濾紙上吸干水分，用電子天平稱重記錄，計算雙腎肥大指數(shù)。在濾紙上將腎臟沿長軸冠狀切為三部分，將中間部分在生理鹽水中漂洗后吸干迅速放入裝有4%多聚甲醛的瓶中固定，石蠟切片后每組10只大鼠共取30張切片做HE染色、Masson染色及免疫組化檢測TGF-β1、p-Smad2和Smad4含量。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，組內(nèi)、組間比較采用重復測量的方差分析、單因素方差分析，兩兩比較方差齊使用LSD法，方差不齊使用Tamhane's T2法。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血壓的變化各組大鼠基礎(chǔ)尾動脈壓相似。與正常鹽組相比，高鹽組收縮壓第六周時明顯升高（P＜0.05），持續(xù)到實驗末，高鹽+左旋氨氯地平干預組收縮壓低于正常鹽組和高鹽組（P＜0.05）（圖1）。

圖1 自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈收縮壓趨勢圖

2.2 雙腎肥大指數(shù)16周時，與正常鹽組相比，高鹽組、高鹽+左旋氨氯地平組的雙腎肥大指數(shù)顯著增高（P＜0.05），高鹽組與高鹽+氨氯地平組相比無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 SHR大鼠雙腎肥大指數(shù)（n=20，±s）

表1 SHR大鼠雙腎肥大指數(shù)（n=20，±s）

注：與高鹽組相比，aP＜0.05；與高鹽+氨氯地平組相比，b P＜0.05

分組 雙腎重量/體重（mg/g）正常鹽組 5.16±0.47高鹽組 6.97±0.51a高鹽+氨氯地平組 6.78±0.83b

2.3 腎組織HE染色腎臟組織HE染色切片可見，高鹽組腎小球存在球囊粘連硬化，正常鹽組、高鹽+氨氯地平組未見球囊粘連（圖2）。

圖2 腎臟組織HE染色（×400）

2.4 Masson染色高鹽組腎小管間質(zhì)中存在明顯的纖維化，高鹽+氨氯地平組未見間質(zhì)纖維化。（圖3）。

圖3 腎臟組織Masson染色（×200）

2.5 腎臟組織免疫組化檢測TGF-β1表達通過免疫組化染色，TGF-β1定位于胞漿，陽性信號為棕黃色，高鹽組TGF-β1的表達較正常鹽組增多，高鹽+氨氯地平組TGF-β1表達較另外兩組減少（圖4）。高鹽組腎臟組織TGF-β1表達的平均光密度值（MOD）高于正常鹽組（P＜0.05），高鹽+氨氯地平組腎臟組織TGF-β1表達的MOD低于另外兩組（P＜0.05）（表2）。

圖4 腎臟組織TGF-β1表達（×200）

表2 SHR大鼠腎臟組織TGF-β1的表達比較（n=5，±s）

表2 SHR大鼠腎臟組織TGF-β1的表達比較（n=5，±s）

注：正常鹽組與高鹽組相比，aP＜0.05；正常鹽組、高鹽組與高鹽+氨氯地平組相比，bP＜0.05

分組 TGF-β1（MOD）正常鹽組 0.124±0.036高鹽組 0.145±0.064a高鹽+氨氯地平組 0.067±0.019b

3 討論

原發(fā)性高血壓的機制復雜，是遺傳及環(huán)境因素等多因素共同作用的結(jié)果，攝鹽量增加與高血壓的發(fā)生、發(fā)展乃至靶器官的損害密切相關(guān)。而高血壓靶器官損害對人群危害巨大，嚴重者可致死、致殘，據(jù)統(tǒng)計在美國高血壓合并腎損害的死亡率為10%，高血壓腎病目前已成美國終末期腎衰的第二大病因，在我國高血壓合并腎損害不在少數(shù)，我國高血壓人群中鹽敏感性高血壓約占60%，據(jù)統(tǒng)計我國人群日常鹽攝入量明顯高于歐美國家，北方更甚，而2013年世界衛(wèi)生組織發(fā)布了膳食鹽及鉀攝入新指南建議成年人每天攝入鈉不應超過2000 mg，即不超過5 g鹽。高鹽飲食無疑會加劇腎臟等靶器官損害。因此，通過限鹽及合理的藥物治療以降低血壓減少靶器官的損害是高血壓治療的關(guān)鍵。

高血壓腎損害的主要病理表現(xiàn)為系膜基質(zhì)增生、腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。其中，組織纖維化與TGF-β高表達有確切關(guān)系。TGF-β是一類分泌型信號分子，它參與調(diào)節(jié)各種不同的細胞反應，包括增殖、分化、遷移和凋亡[6]。臨床和實驗證明TGF-β在腎臟疾病發(fā)展的過程中起著至關(guān)重要的作用，它可促進細胞外基質(zhì)的合成分泌，抑制其降解，誘導腎間質(zhì)的成纖維細胞聚集，是促進腎臟纖維化的關(guān)鍵因子[7,8]。在許多腎臟病患中可發(fā)現(xiàn)TGF-β沉積增加，組織和尿液中的TGF-β水平往往被作為腎臟疾病預后的檢測指標。拮抗TGF-β信號可防止終末期腎臟疾病的腎損傷進一步發(fā)展[9]。TGF-β有三種同分異構(gòu)體：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1在腎組織中含量最多。1998年就有學者發(fā)現(xiàn)正常腎臟過表達TGF-β1可導致纖維化[10]。TGF-β1刺激腎小球系膜細胞纖維化的通路是TGF-β1/smad。TGF-β信號從細胞膜表面?zhèn)鬟f至細胞核的機制中，smad2的磷酸化起著關(guān)鍵性作用，磷酸化后的smad2對smad4的親和力增強，兩者結(jié)合成復合物后轉(zhuǎn)運到細胞核，在細胞核應答TGF-β的轉(zhuǎn)錄功能[11]。高鹽飲食不僅使炎癥因子水平增加，可導致TGF-β的高表達[12,13]，高鹽可激活內(nèi)皮細胞上的大電導鈣依賴性鉀通道（BKCa），該通道的激活可促進信號通過富含脯氨酸的酪氨酸激酶-2、c-Src、Akt（也被稱為蛋白激酶B）和絲裂原活化蛋白激酶途徑導致內(nèi)皮產(chǎn)生TGF-β[14]，我們研究發(fā)現(xiàn)高鹽組較正常鹽組TGF-β表達增加。

氨氯地平是第三代鈣離子拮抗劑，它的降壓效果以及在靶器官保護方面的作用是肯定的，但是它對腎臟起保護作用的具體機制仍不十分明確。曾有學者通過實驗證實，氨氯地平可通過其抗氧化、抗凋亡機制對抗阿霉素介導的腎毒性損害[15]。近年來，對氨氯地平的研究有了新的進展，Lai等研究發(fā)現(xiàn)氨氯地平可抑制自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞TGF-β1的表達從而起到抗增殖的作用[16]。不僅如此，還有研究表明氨氯地平血藥濃度為10-4mol/L時可減少單核細胞TGF-β的分泌，從而抑制單核細胞增殖起到抗動脈粥樣硬化的作用[17]。最近有學者通過細胞實驗證明了氨氯地平可通過抑制TGF-β/smad信號通路中間物p-smad2和smad4的表達，進而抑制阿霉素對鼠腎小球系膜細胞產(chǎn)生的毒性作用[18]。我們的實驗中亦觀察到，氨氯地平干預后SHR大鼠腎臟纖維化程度減輕，同時TGF-β1表達下降。也有文獻指出相較于氨氯地平單藥治療，與ACEI或ARB等藥物聯(lián)用，在降低炎癥因子、降壓及靶器官保護方面的獲益更大[19]。

綜上所述，高鹽飲食與高血壓及靶器官損害密切相關(guān)，高血壓防治首先在于飲食習慣和生活方式的轉(zhuǎn)變，在減少鹽攝入的基礎(chǔ)上，對于血壓控制不達標的患者予以藥物治療，必要時可聯(lián)合用藥，最終目的是控制危險因素，保護靶器官。