磁共振(MRI)擴(kuò)散峰度成像(DKI)與拉伸指數(shù)模型(SEM)評價裸鼠原位肝細(xì)胞癌(HCC)異質(zhì)性

郭 然 林 江 楊爍慧,3△ 韓志宏 嚴(yán) 序 傅彩霞 趙夢龍

(1上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放射科 上海 200032;3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院放射科,4病理科 上海 200021;5西門子醫(yī)療磁共振科研市場部 上海 201318;6西門子(深圳)磁共振有限公司應(yīng)用開發(fā)部 深圳 518057)

腫瘤異質(zhì)性 (tumor heterogeneity) 是指腫瘤內(nèi)及腫瘤間存在的基因和表型的差異,受到基因與環(huán)境的共同作用,是造成腫瘤致死、治療無效及藥物抵抗的重要原因之一[1-2]。腫瘤異質(zhì)性一定程度上反映了腫瘤的生物學(xué)特征,如生長方式、侵襲能力和對藥物的敏感性等,它涵蓋多方面,其中包括隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及與治療相關(guān)的空間及時間異質(zhì)性[3]。

磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging,DWI)可用于評估腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤壞死程度[4]。由于腫瘤組織內(nèi)水分子擴(kuò)散不符合高斯分布,傳統(tǒng)DWI模型無法評價腫瘤的異質(zhì)性[5]。有研究指出MRI擴(kuò)散峰度成像(diffusion kurtosis imaging,DKI)和拉伸指數(shù)模型(stretched exponential model,SEM)有助于腫瘤異質(zhì)性的評估,并可用于鑒別腫瘤良惡性、區(qū)分高低級別、評價預(yù)后以及監(jiān)測療效[5-8]。

目前,使用DKI和SEM評估肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)腫瘤異質(zhì)性的報道較少[9-11],而與組織病理學(xué)相對照的研究更少。本實驗通過建立裸鼠原位HCC模型,觀察在自然生長狀態(tài)下腫瘤的空間異質(zhì)性及隨時間延長而改變的時間異質(zhì)性,分析不同時間點(diǎn)間DKI和SEM各參數(shù)間的差異,以及各參數(shù)與組織病理學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性,從而客觀評估DKI和SEM方法用于觀察HCC腫瘤空間和時間異質(zhì)性的價值。

材 料 和 方 法

實驗造模和實驗方案 本實驗通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實驗動物管理委員會備案和批準(zhǔn)。使用人HCC-LM3細(xì)胞系和4～6周齡體質(zhì)量為23～25 g的BALB/c雄性裸鼠(中國科學(xué)院上海藥物研究所)建立裸鼠原位HCC模型[4]。將相同體積人HCC-LM3細(xì)胞瘤塊(1 mm3)植入25只裸鼠肝左葉包膜下,并將25只瘤鼠隨機(jī)分為A、B、C、D和E組,每組5只,分別在腫瘤生長至第21、28、35、42和49天進(jìn)行MRI掃描[12]。

MRI掃描方法 瘤鼠按40 mg/kg腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,然后俯臥位固定于動物架上,在西門子MAGNETOM Aera 1.5T磁共振成像儀上使用16通道腕關(guān)節(jié)線圈分別進(jìn)行常規(guī)MRI (T1WI和T2WI橫斷位,T2WI冠狀位)和DKI-SEM序列掃描。常規(guī)T1WI和T2WI掃描均采用自旋回波序列,層厚2 mm,層間距0.2 mm,視野100 mm×100 mm。DKI-SEM序列為單次激發(fā)平面回波擴(kuò)散加權(quán)成像序列,層厚2 mm,層間距0.4 mm,視野176 mm×295 mm,TR 5 000.0 ms,TE 75.0 ms,帶寬1 405 Hz/像素,掃描矩陣118×198;所用6個b值(激勵次數(shù))為0 (1)、500 (2)、800 (3)、1 000 (4)、1 500 (6)和2 000 (6) s/mm2[9,13],每個非零b值均采用3個相互正交的擴(kuò)散編碼方向,并行采集加速因子為2。

圖像后處理和測量 掃描完成后,將瘤鼠的DKI-SEM原始DICOM圖像導(dǎo)入電腦,使用基于Mathworks的 MATLAB軟件編寫的圖像處理程序,利用高斯濾波器以3 mm的半高全寬值抑制擴(kuò)散加權(quán)圖像的噪聲[14]。分別根據(jù)以下模型對逐個體素進(jìn)行DKI和SEM信號擬合獲得各參數(shù)圖:S(b)/S(0)=exp(-b·MD + 1/6·b2·MD2·MK);S(b)/S(0)=exp[-(b·DDC)α][5]。其中,S(b)代表擴(kuò)散加權(quán)因子為b時的信號強(qiáng)度;S(0)代表無擴(kuò)散加權(quán)因子時的信號強(qiáng)度。平均擴(kuò)散系數(shù)(mean diffusivity,MD)表示校正非高斯運(yùn)動后的表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient,ADC)值;平均峰度(mean kurtosis,MK)反映水分子運(yùn)動偏離高斯分布的程度;擴(kuò)散分布指數(shù)(distributed diffusion coefficient,DDC)代表組織平均擴(kuò)散速率;α是擴(kuò)散異質(zhì)性指數(shù),描述組織內(nèi)水分子擴(kuò)散的不均勻性[5]。傳統(tǒng)單指數(shù)擴(kuò)散模型所產(chǎn)生的ADC由圖像處理程序自動生成。在對瘤鼠模型分組和組織病理學(xué)結(jié)果均不知情的情況下,2名分別具有12年和25年肝臟MRI診斷經(jīng)驗的醫(yī)師對圖像進(jìn)行后處理分析和評價:先在T2WI橫斷位圖像上選取腫瘤最大徑層面、測量腫瘤最大徑以獲得腫瘤大小[4],然后參照T1WI和T2WI橫斷位圖像,避開出血區(qū)域,分別在ADC圖像上于腫瘤最大徑層面沿腫瘤邊緣手動勾畫感興趣區(qū)(region of interest,ROI)[4,14],再自動拷貝到DKI和SEM各參數(shù)圖上(圖1、2)。每個觀察者在同一腫瘤同一層面上測量2次,結(jié)果取平均值,1個月后重復(fù)該項操作。將具有25年診斷經(jīng)驗的醫(yī)師2次得到的均值再次平均獲得最終結(jié)果,用于后續(xù)的統(tǒng)計學(xué)分析。

組織病理學(xué)檢查 MRI掃描結(jié)束后處死瘤鼠,取下腫瘤連同肝臟放入10 %緩沖甲醛溶液中固定24 h。根據(jù)DKI和SEM掃描層厚度,取腫瘤中央約2 mm組織進(jìn)行石蠟包埋,薄切為3 μm厚度的切片后染色。由具備10年診斷經(jīng)驗的病理科醫(yī)師使用Aperio ScanScope和Leica SCN400對組織病理學(xué)切片行全景掃描后導(dǎo)出數(shù)字化圖像,使用SlidePath Gateway Client軟件對這些圖像進(jìn)行觀察、放大、攝片、并以JPG格式保存,然后再將JPG圖像導(dǎo)入ImageJ(V1.48)和Image-Pro Plus(V6.0)軟件后獲得組織病理學(xué)結(jié)果。首先行HE染色顯示腫瘤整體、細(xì)胞和組織的形態(tài)及結(jié)構(gòu),經(jīng)全景掃描獲得的原始數(shù)字化圖片(腫瘤中央切面)轉(zhuǎn)換成JPG圖片后,再通過ImageJ軟件轉(zhuǎn)換成灰階圖,后者中每個像素均附有對應(yīng)的灰度值,接著對圖片進(jìn)行直方圖分析獲得像素灰度的分布情況,然后測量得到反映腫瘤空間異質(zhì)性的指標(biāo)即標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)和峰度[15-18]。其次,將HE染色的腫瘤圖像放大20倍后隨機(jī)取5個區(qū)域計算得到壞死分?jǐn)?shù)(necrotic fraction,NF),NF為視野內(nèi)腫瘤壞死面積/視野內(nèi)腫瘤面積[19]。行抗CD31染色以獲取腫瘤內(nèi)微血管密度(micro-vessel density,MVD),即先將抗CD31染色腫瘤圖像放大4倍,找到3個抗CD31染色陽性血管最密集的區(qū)域,然后放大20倍進(jìn)行血管計數(shù),得到腫瘤最大微血管密度[4]。行抗Ki-67染色觀察腫瘤內(nèi)細(xì)胞增殖情況,在抗Ki-67染色腫瘤圖像上隨機(jī)選取5個區(qū)域放大20倍后計算陽性細(xì)胞數(shù)占比,得到Ki-67指數(shù)[20]。

Transverse T2WI shows the greatest dimension of a tumor (A).ADC map for ROI outlining the tumor (B).Images of MK map (C),MD map (D),α map (E) and DDC map (F) of the tumor (MK=1.170,MD=0.622×10-3mm2/s,α= 0.795,DDC = 0.493×10-3mm2/s).HE staining image shows patchy and irregular necrosis (G,black arrows,10×) in the tumor.Anti-CD31 and anti-Ki-67 immunohistochemistry images show intratumoral micro-vessels (H,black arrows,20×) and Ki-67 positive cells (I,black arrows,20×) in the tumor.

圖1 B組(第28天) HCC瘤鼠DKI和SEM各參數(shù)圖和組織病理學(xué)切片
Fig 1 DKI and SEM images and corresponding histopathological images of a nude mouse with xenograft HCC of group B (on the 28thday)

Transverse T2WI shows the greatest dimension of a tumor (A).ADC map for ROI outlining the tumor (B).Images of MK map (C),MD map (D),α map (E) and DDC map (F) of the tumor (MK=1.250,MD=0.684×10-3mm2/s,α=0.780,DDC=0.543×10-3mm2/s).HE staining image shows massive necrosis (G,black arrows,10×) in the tumor.Anti-CD31 and anti-Ki-67 immunohistochemistry images show intratumoral micro-vessels (H,black arrows,20×) and Ki-67 positive cells (I,black arrows,20×) in the tumor.

圖2 E組(第49天) HCC瘤鼠DKI和SEM各參數(shù)圖和組織病理學(xué)切片
Fig 2 DKI and SEM images and corresponding histopathological images of a nude mouse with xenograft HCC of group E (on the 49thday)

結(jié) 果

裸鼠原位HCC模型各組掃描結(jié)果 DKI-SEM掃描在25只瘤鼠中均順利完成,各參數(shù)圖中腫瘤均顯示清晰,各參數(shù)的觀察者內(nèi)和觀察者間測定的一致性良好(ICCs=0.897-0.947)。各組中共有5只瘤鼠(B組1只,C組1只,D組1只和E組2只)肉眼可見腫瘤內(nèi)出血,但均未發(fā)生于腫瘤測量層面。

裸鼠原位HCC模型各組間DKI和SEM各參數(shù)的比較 各組間MK、MD、α和DDC值差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。腫瘤MK值隨時間延長逐漸上升,種植瘤生長至第49天(E組),MK值下降;其中,D組MK值明顯高于A組和B組(Z=-2.410和-2.410,P=0.016和0.016),E組明顯低于D組(Z=-2.417,P=0.016)。腫瘤α值隨時間延長逐漸降低,但在E組有所升高;其中,D組明顯低于A組和B組(Z=-2.522和-1.991,P=0.012和0.047),E組顯著高于D組(Z=-2.200,P=0.028)。B組腫瘤MD和DDC值較A組略有下降,但未見統(tǒng)計學(xué)差異,而C組至E組的MD和DDC值逐漸上升;其中,D組顯著高于B組(MD:Z=-2.095,P=0.036;DDC:Z=-1.997,P=0.046),E組顯著高于B組和C組(MD:Z=-2.200和-2.200,P=0.028和0.028;DDC:Z=-2.402和-2.095,P=0.016和0.036)。其余組間腫瘤MK、MD、α和DDC值均未見統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 裸鼠原位HCC模型各組間DKI和SEM各參數(shù)的比較
Tab 1 Comparisons of DKI and SEM parameters of nude mice with xenograft HCC among different groups

GroupMKMD (×10-3mm2/s)αDDC (×10-3mm2/s)A (21st d)1.182±0.0490.677±0.0150.813±0.0080.517±0.017B (28th d)1.200±0.0300.642±0.0260.799±0.0130.495±0.017C (35th d)1.240±0.0230.651±0.0210.794±0.0180.511±0.025D (42nd d)1.279±0.0250.670±0.0170.766±0.0180.526±0.017E (49nd d)1.200±0.0410.686±0.0170.804±0.0150.539±0.017χ212.44811.26110.6479.711P0.0140.0240.0310.046

HCC:Hepatocellular carcinoma;DKI:Diffusion kurtosis imaging;SEM:Stretched exponential imaging;MK:Mean kurtosis;MD:Mean diffusivity;DDC:Distributed diffusion coefficient.

裸鼠原位HCC模型各組間腫瘤大小和組織病理學(xué)指標(biāo)的比較 裸鼠原位HCC腫瘤不斷增大,B組和C組明顯大于A組(Z=-2.660和-2.635,P=0.008和0.008),D組明顯大于A組和B組(Z=-2.627和-2.333,P=0.009和0.020),E組明顯大于A、B、C和D組(Z=-2.627、-2.643、-2.009和 -1.997,P=0.009、0.008、0.045和0.046)。SD和峰度值在B、C和D組逐漸升高,在E組則有所降低;其中,C組顯著高于A組(SD:Z=-2.193,P= 0.028;峰度:Z=-2.193,P=0.028),D組顯著高于A、B和C組(SD:Z=-2.611、-2.611和 -2.193,P=0.009、0.009和0.028;峰度:Z=-2.611、-2.611和-2.611,P=0.009、0.009和0.009),E組顯著低于D組(SD:Z=-2.611,P=0.009;峰度:Z=-2.611,P=0.009)。隨時間延長,HCC腫瘤的NF、MVD和Ki-67指數(shù)均有所升高,各組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。C組NF明顯大于A組和B組(Z=-2.611和-2.611,P=0.009和0.009),D組明顯大于A、B和C組(Z=-2.611、-2.611和 -2.402,P=0.009、0.009和0.016),E組明顯大于A、B、C和D組(Z均=-2.611,P均=0.009)。D組和E組的MVD明顯高于A組(Z=-2.227和-2.627,P=0.026和0.009)。C組的Ki-67指數(shù)明顯高于A組(Z=-2.402,P= 0.016),D組和E組的Ki-67指數(shù)明顯高于A組和B組(D組:Z=-2.611和-2.611,P=0.009和0.009;E組:Z=-2.611和-2.611,P=0.009和0.009)。

表2 裸鼠原位HCC各組間組織病理學(xué)指標(biāo)的比較
Tab 2 Comparisons of histopathological results of nude mouse xenograft HCC among different groups

GroupSDKurtosisNF (%)MVDKi-67 index (%)Tumor size (cm)A (21st d)15.804±0.699(-9.346)±2.15811.643±1.20122.000±0.27415.934±0.9851.240±0.136B (28th d)16.153±0.758(-6.256)±2.36612.991±1.39722.400±1.09117.206±0.6751.660±0.080C (35th d)17.119±1.110(-1.350)±4.48719.272±1.61622.650±1.05618.975±1.4641.940±0.301D (42nd d)19.203±0.6064.103±0.81227.464±4.18223.817±1.00120.785±1.4382.000±0.200E (49th d)16.724±0.730(-5.507)±1.94739.529±1.30923.877±0.77321.162±1.3262.160±0.206χ214.55516.50522.16110.23417.17718.961P0.0060.002< 0.0010.0370.0020.001

SD:Standard deviation;NF:Necrotic fraction;MVD:Micro-vessel density.

裸鼠原位HCC模型DKI和SEM各參數(shù)與組織病理學(xué)各指標(biāo)間的相關(guān)性 5組HCC腫瘤的MK值與SD和峰度值呈高度正相關(guān)(P均=0.001),α值與SD和峰度值呈高度負(fù)相關(guān)(P均=0.001)。5組腫瘤的MK和α值與NF、MVD、Ki-67指數(shù)以及腫瘤大小未見明顯相關(guān)性;去除E組后,MK值與上述各指標(biāo)均呈顯著中度正相關(guān)(P均<0.05),α值與上述各指標(biāo)呈顯著中度負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。5組腫瘤MD和DDC值與NF呈中度正相關(guān)(P均<0.05),與腫瘤大小則未見明顯相關(guān)性;去除A組后,二者與NF呈顯著高度正相關(guān)(P均=0.001),與腫瘤大小呈顯著中度正相關(guān)(P均<0.05,表3)。

表3 裸鼠原位HCC各組DKI和SEM各參數(shù)與組織病理學(xué)各指標(biāo)間的相關(guān)性Tab 3 Correlations between DKI and SEM parameters and histopathological results of nude mouse xenograft HCC at different time points among groups

討 論

空間和時間異質(zhì)性是腫瘤異質(zhì)性的重要方面之一,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療過程中腫瘤內(nèi)部不同成分的演變有關(guān)[3,22]。腫瘤空間異質(zhì)性越高,預(yù)后越差[3]。腫瘤異質(zhì)性在腫瘤的臨床診斷、治療和預(yù)后評價等方面具有重要價值。本研究發(fā)現(xiàn)DKI和SEM方法能夠一定程度上反映HCC的空間異質(zhì)性,并監(jiān)測到HCC自然生長狀態(tài)下,腫瘤異質(zhì)性隨時間的延長而變化,與組織病理學(xué)指標(biāo)相關(guān)。因此,DKI和SEM參數(shù)或許可以成為評價腫瘤時空異質(zhì)性的生物影像學(xué)指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)隨時間的延長,腫瘤大小不斷增大,NF、MVD、Ki-67指數(shù)不斷升高。進(jìn)一步分析腫瘤HE染色切片,發(fā)現(xiàn)在第28、35、42天,裸鼠原位HCC的SD和峰度值均有所升高,而在第49天,腫瘤的SD和峰度值降低。有研究者指出腫瘤的SD和峰度值越大,組織的空間異質(zhì)性越大[17- 18]。本研究組織病理學(xué)檢查證實裸鼠原位HCC于自然生長狀態(tài)下從第21天至第42天腫瘤空間異質(zhì)性增大,在第49天有所減小。

MK反映水分子運(yùn)動偏離高斯分布的程度,MK為0時,水分子運(yùn)動符合高斯分布。α值反映組織內(nèi)水分子擴(kuò)散的不均勻性,范圍為0～1,α越接近1說明信號衰減越接近單指數(shù)模型信號衰減。MK和α均與組織的復(fù)雜程度有關(guān),MK值越高、α值越低代表組織異質(zhì)性越大[13,23]。在乳腺癌的研究中,發(fā)現(xiàn)高級別腫瘤MK值明顯高于低級別腫瘤,腫瘤MK值與組織學(xué)分級和腫瘤增殖指標(biāo)Ki-67指數(shù)顯著正相關(guān)[14,20];腫瘤直徑越大、Ki-67指數(shù)越高的腫瘤α值越小[24]。Ren等[25]對膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn)高級別腫瘤的α值明顯低于低級別腫瘤,α值與腫瘤組織學(xué)分級和Ki-67指數(shù)存在顯著負(fù)相關(guān)。本研究在HCC模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,在去除第49天的E組后,腫瘤MK值與Ki-67指數(shù)和腫瘤大小中度正相關(guān),α值與Ki-67指數(shù)和腫瘤大小中度負(fù)相關(guān)。同時,我們還發(fā)現(xiàn)MK和α值與NF、MVD之間也存在中度相關(guān)性。以上結(jié)果說明在HCC的生長早期,細(xì)胞增殖、血管生成以及區(qū)域性壞死是造成腫瘤異質(zhì)性增大的主要因素[26]。但到第49天,腫瘤壞死面積逐漸增大(此時NF明顯升高),大面積及較均勻分布的壞死一定程度上使腫瘤空間異質(zhì)性降低,表現(xiàn)為MK值下降和α值上升。與本研究結(jié)果相仿,Shi等[27]對裸鼠胃癌模型的研究也同樣發(fā)現(xiàn)在實驗觀察時間段內(nèi)對照組腫瘤的MK值存在先上升后下降的趨勢。同時,我們還發(fā)現(xiàn)5組腫瘤的MK和α值與反映腫瘤空間異質(zhì)性的組織病理學(xué)指標(biāo)SD和峰度值間高度相關(guān)。因此,MK和α能夠反映HCC的腫瘤空間異質(zhì)性,并可用于監(jiān)測其隨時間變化的情況。

MD和DDC是反映水分子擴(kuò)散的指標(biāo),與傳統(tǒng)DWI的ADC值存在相關(guān)性,能較ADC更準(zhǔn)確地反映組織內(nèi)水分子擴(kuò)散情況[28]。隨著腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤增大和細(xì)胞外間隙減小,在某一時間點(diǎn),腫瘤達(dá)到最密實的狀態(tài),此時MD和DDC值降低。之后隨著腫瘤的生長,腫瘤體積增大,其血管生成已經(jīng)無法滿足細(xì)胞增殖和腫瘤生長的需要,瘤內(nèi)壞死逐漸增多,使擴(kuò)散系數(shù)MD和DDC值增大[12]。在去除第21天的A組后,我們觀察到MD和DDC值與NF之間的相關(guān)性較未去除A組前更大,達(dá)到高度正相關(guān),并且與腫瘤大小中度正相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)MD和DDC值與腫瘤異質(zhì)性指標(biāo)SD和峰度、Ki-67指數(shù)和MVD之間的相關(guān)性,其原因可能是在觀察時間段內(nèi),MD和DDC并不是反映HCC的腫瘤異質(zhì)性、細(xì)胞增殖和血管生成的敏感指標(biāo)。

本實驗存在一些局限性。首先,為了更好地將DKI和SEM各參數(shù)與組織病理學(xué)相對照,我們選擇在腫瘤最大徑層面上測定,因此對腫瘤整體異質(zhì)性的反映有限[29],且病理切片與DKI和SEM圖像可能不完全匹配。第二,盡管我們勾畫ROI時避開了出血區(qū)域,但MRI上肉眼不能分辨的微出血的存在可能對結(jié)果產(chǎn)生一定影響。第三,每個時間點(diǎn)的瘤鼠只有5只,樣本量較少,未來需要擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步驗證本研究結(jié)果。最后,本實驗所研究的DKI和SEM參數(shù)可能僅反映了HCC腫瘤異質(zhì)性的某些方面,最近一項基于血氧水平依賴和動態(tài)增強(qiáng)MRI的直方圖分析也發(fā)現(xiàn)能夠定量分析HCC腫瘤異質(zhì)性,但技術(shù)更復(fù)雜、耗時更長[30]。

綜上所述,DKI和SEM能夠一定程度上反映HCC自然生長狀態(tài)下隨時間的延長而變化的腫瘤空間異質(zhì)性,或可成為臨床評價HCC腫瘤時空異質(zhì)性的生物影像學(xué)指標(biāo)。

doi:10.1002/jmri.26523.