維生素D受體基因遺傳變異對慢性變應(yīng)性鼻炎的預(yù)警作用

陳賽明，周小柳，周利民，李志路，張云霞

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)又稱為過敏性鼻炎，表現(xiàn)為致敏個體再次接觸變應(yīng)原后，變應(yīng)原與機體內(nèi)炎性細胞表面的特異性IgE結(jié)合，導(dǎo)致機體出現(xiàn)鼻塞、流涕、噴嚏等一系列癥狀的慢性非感染性炎性反應(yīng)[1]，表現(xiàn)為免疫性疾病的特點。而近些年來，維生素D在免疫性疾病中的調(diào)節(jié)作用日益受到重視，比如血清中維生素D的水平與AR的發(fā)生存在相關(guān)性[2]。維生素D受體(vitaminD receptor,VDR)是維生素D的活性形式發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用的關(guān)鍵成分，其結(jié)構(gòu)及活性的改變都可能成為影響維生素D功能的重要因素[3]。近年研究表明，人群中基因多態(tài)性形式是形成個體差異和疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，可成為疾病發(fā)生和預(yù)警的標(biāo)記[4]。VDR基因存在眾多單核苷酸多態(tài)性(single nuclear polymorphism,SNP)位點，而關(guān)于其遺傳多態(tài)性與AR的關(guān)聯(lián)性研究較少。因此，筆者選擇了VDR 5個SNP位點rs7975232、rs2228570、rs731236、rs1544410及rs11568820進行病例對照研究，以期探尋上述SNP位點與AR的相關(guān)性及預(yù)警價值。由于基因分型的方法不同，此文僅報道rs731236、rs1544410及rs11568820三個位點的研究結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月—12月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的94例變應(yīng)性鼻炎患者作為試驗組(AR組)，選擇同期在醫(yī)院健康體檢的健康人113例作為健康對照組(HC組)。AR組男53例，女41例，年齡30～52(42.13±7.02)歲；健康對照組男70例，女43例，年齡30～50(41.25±6.88)歲。2組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有AR患者均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)入選者近期未接受糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥等藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)變態(tài)反應(yīng)性疾病史者；(2)血液病者；(3)寄生蟲病史者；(4)合并哮喘、特應(yīng)性皮炎等變應(yīng)性疾病者；(5)自身免疫性疾病者。

1.3 基因分型方法 采集所有入選者EDTAK2抗凝血2 ml，取200 μl進行基因組DNA提取及質(zhì)量鑒定。委托上海捷瑞生物工程有限公司對樣本進行VDR基因多態(tài)性位點的分型。具體過程如下：合成引物P1(5′-GGTGGGATTGAGCAGTGA-3′)、P2(5′-TCTTGGCATAGAGCAGGTG-3′)進行PCR擴增包含rs731236的193bp的PCR片段；合成引物P3(5′-GTGTGCAGGCGATTCGTAGG-3′)、P4(5′-GGAAGAGGTCAAGGGTCACTG-3′)進行PCR擴增包含rs1544410的185bp的片段；合成引物P5(5′-GAGGGAGGGAGGAAGGAA-3′)、P6(5′-CTGTAGCAATGAAAGCAAACCA-3′)進行PCR擴增包含rs11568820的199bp的片段。純化后分別對上述PCR產(chǎn)物進行延伸，延伸產(chǎn)物各取10 μl，利用美國ABI公司的3730XL基因測序儀進行序列測定及數(shù)據(jù)讀取。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SNPStats軟件進行分析，連鎖不平衡分析采用Hardy-Weinberg模型，基因型分布頻率采用Logistic 回歸分析，基因型的組間差異用共顯性、顯性、隱性模型3個模型驗證。利用SPSS 25.0軟件對等位基因的分布頻率進行χ2分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VDR基因3個SNP的基本信息 本研究選取3個SNP位點作為研究對象，根據(jù)NCBI(SNP)數(shù)據(jù)庫中的信息，rs731236位于編碼區(qū)內(nèi)，存在T/C兩種形態(tài)，其中T為野生型等位基因，全球發(fā)生頻率為0.720，突變基因型C屬于次要等位基因，全球發(fā)生頻率為0.280；rs1544410和rs11568820屬于內(nèi)含子突變，均存在G/A兩種多態(tài)性，前者野生型等位基因為G，全球發(fā)生頻率為0.700，后者野生型等位基因為A，全球發(fā)生頻率為0.543；在NCBI數(shù)據(jù)庫給出的信息中，rs731236突變可能存在臨床意義，而其他兩個SNP位點的突變則未發(fā)現(xiàn)，見表1。

表1 VDR基因3個SNP位點的基本信息

注：本表信息提取于2018年10月18日NCBI(SNP)數(shù)據(jù)庫

2.2 VDR基因3個SNP的基因型檢測及與AR相關(guān)性分析 rs11568820在受試人群中均檢測出GG、AG、AA 3種基因型,在AR組和對照組中的分布頻率分別為29.8%/34.5%、51.1%/51.3%、19.1%/14.2%，SNPState在線分析結(jié)果顯示共顯性模型、顯性模型、隱性模型的檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs731236和rs1544410在受試人群中均檢測出野生型純合子和雜合子2種基因型，rs731236野生型純合子TT和雜合子CT在試驗組和對照組中的分布頻率分別為87.2%/90.3%、12.8%/9.7%,AR組中雜合子的發(fā)生頻率高于對照組，說明突變可能與AR相關(guān)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；rs1544410的野生型純合子GG和雜合子AG在AR組和對照組中的發(fā)生頻率分別為90.4%/90.3%、9.6%/9.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 3個SNP位點等位基因發(fā)生頻率及與AR相關(guān)性分析 rs11568820位點突變等位基因A在AR組中的分布頻率高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs731236、rs154410兩個多態(tài)性位點的等位基因分布頻率組間比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

3 討 論

AR屬于多基因遺傳變態(tài)反應(yīng)性疾病，并以嗜酸性粒細胞趨化、轉(zhuǎn)移并聚集于鼻黏膜組織為主要病理學(xué)特征，同時可釋放大量炎性介質(zhì)進而加重鼻黏膜損傷[6]。研究表明，許多參與細胞增殖分化及凋亡的信號通路與AR的發(fā)生密切相關(guān)，例如Notch信號通路、維生素D信號通路，均可通過影響免疫細胞的生命活動而對鼻炎的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生密切調(diào)節(jié)和影響[7-8]。維生素D信號通路的主要成分包括維生素D結(jié)合蛋白(GC)、細胞色素P450家族成員(CYP2R1)、維生素D受體等。維生素D代謝通路除了影響鈣磷代謝之外，還參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。喬俊英等[9]研究發(fā)現(xiàn)，適量1,25-(OH)2D3可能通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在哮喘發(fā)病中起重要作用。桂明才等[10]則認為維生素D3可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)喉癌細胞凋亡。

表3 維生素D受體3個SNP位點等位基因分布頻率與AR關(guān)聯(lián)性分析 [基因數(shù)(%)]

維生素D受體作為維生素D信號通路中的關(guān)鍵成分，其結(jié)構(gòu)與功能對維生素D的代謝及功能發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。尤其是關(guān)于VDR基因多態(tài)性與疾病發(fā)生的相關(guān)性研究越來越多，有研究表明VDR受體基因多態(tài)性與北京地區(qū)老年男性原發(fā)性高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[11]，陳詠等[12]研究發(fā)現(xiàn)VDR多態(tài)性與多囊卵巢綜合征的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，王麗等[13]則研究了VDR受體基因多態(tài)性與鼻咽癌的關(guān)聯(lián)性。

在本研究中，選擇了2017年在醫(yī)院住院治療的AR患者及健康對照者進行對照研究，多態(tài)性位點rs11568820檢測出野生型純合子、雜合子、突變型純合子3種基因型，而所選擇的其他2個位點rs731236、rs1544410 則只檢測出野生型純合子及雜合子2種基因型。對rs11568820的3種基因型進行遺傳學(xué)模型統(tǒng)計分析，結(jié)果表明共顯性模型、顯性模型、隱性模型組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對rs731236、rs1544410這2個位點進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，對AR組和健康對照組3個多態(tài)性位點的等位基因分布頻率進行了分析，結(jié)果差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 VDR基因多態(tài)性與AR的關(guān)聯(lián)性分析 [例(%)]

rs11568820位于12號染色體(47908762)，該區(qū)域?qū)儆赩DR基因的啟動子區(qū)。NCBI數(shù)據(jù)庫中有超過80條文獻對該位點與血清維生素D的水平及疾病的關(guān)聯(lián)性進行了研究。Yin 等[14]研究發(fā)現(xiàn)此SNP位點與中國人群的胃癌發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，Yang等[15]則發(fā)現(xiàn)該位點與中國華北地區(qū)人群的食管癌有關(guān)。這說明rs11568820可能通過影響VDR的表達而影響維生素D信號通路的作用。本研究首次報道了rs11568820與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明,3種基因型在2組中的分布頻率并未呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，提示該位點的多態(tài)性與慢性變應(yīng)性鼻炎的關(guān)聯(lián)性不強。

rs731236屬于VDR編碼區(qū)密碼子的同義突變，目前NCBI的數(shù)據(jù)庫中有超過200條文獻報道了該位點與機體性狀及疾病的關(guān)聯(lián)性。rs1544410屬于VDR編碼基因的內(nèi)含子突變。Tian等[16]在2015年報道了關(guān)于上述2個SNP位點與中國人群AR的關(guān)聯(lián)性研究，未發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)性。本次針對rs731236及rs1544410的研究也未發(fā)現(xiàn)與AR的關(guān)聯(lián)性，這與Tian等的研究結(jié)果一致，同時也提示rs731236堿基的形態(tài)變化未影響密碼子的功能及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而內(nèi)含子突變rs1544410也未對VDR的表達產(chǎn)生影響。

綜上，本研究的3個多態(tài)性位點在慢性變應(yīng)性鼻炎患者及健康對照者之間的基因型分布頻率、等位基因分布頻率均不存在統(tǒng)計學(xué)差異，說明這些位點不是慢性變應(yīng)性鼻炎的易感位點。因而，在后續(xù)的研究中，一方面建議增加研究對象的數(shù)量，另一方面建議選取更多的SNP位點進行研究，以期尋找AR的易感SNP位點，從而為其診斷及預(yù)警機制的構(gòu)建提供依據(jù)。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

陳賽明：設(shè)計研究方案，監(jiān)督實施過程，論文撰寫；周小柳、周利民：實施研究過程，資料搜集整理；李志路：進行統(tǒng)計學(xué)分析；張云霞：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文修改、審核