自制新型支氣管肺泡灌洗導(dǎo)管裝置在周圍型肺癌診斷中的應(yīng)用

陳菁，劉旭，楊碩，羅光偉

(武漢市第一醫(yī)院，武漢430022)

目前，臨床常用的肺癌病理診斷方法有痰脫落細(xì)胞檢查、纖維支氣管鏡檢查、經(jīng)皮穿刺肺活檢以及支氣管肺泡灌洗術(shù)(BALF)等[1～6]。其中，痰脫落細(xì)胞檢查是惟一無(wú)創(chuàng)的病理診斷方法，但陽(yáng)性率明顯偏低；纖維支氣管鏡檢查是常用的病理檢查手段，中央型肺癌的確診率可達(dá)100%，但對(duì)于周圍型病變確診率僅在20%～65%[7]；經(jīng)皮穿刺肺活檢經(jīng)過(guò)多年的改進(jìn)和完善已成為肺癌尤其是周圍型肺癌病理診斷的主要手段[8]，但該法易導(dǎo)致氣胸、出血等并發(fā)癥。BALF陽(yáng)性細(xì)胞檢出率較痰脫落細(xì)胞檢查顯著增高[9,10]，且輔以液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(LCT)對(duì)傳統(tǒng)涂片檢查的改進(jìn)，使該法在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越多。p63和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TTF-1)分別為診斷肺鱗癌和腺癌的特異性分子標(biāo)志物，可用于肺癌的分型診斷。近年來(lái)，我們團(tuán)隊(duì)針對(duì)BALF檢查方法進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)了一種新型支氣管肺泡灌洗導(dǎo)管(專利號(hào)：201720265388.7)，以進(jìn)一步提升該檢查方法在周圍型肺癌患者病理組織學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。本研究分別應(yīng)用傳統(tǒng)和自制新型支氣管肺泡灌洗裝置對(duì)周圍型肺癌患者進(jìn)行BALF檢查，比較了在引起患者不適反應(yīng)、采集的細(xì)胞質(zhì)量、診斷的準(zhǔn)確性等方面的差異，以驗(yàn)證該裝置對(duì)BALF檢查的改善提升作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年8月～2017年2月，在通過(guò)結(jié)合患者主訴與影像學(xué)分析初步判定為肺癌的患者中，對(duì)其中適于應(yīng)用BALF檢查者分別選用傳統(tǒng)支氣管肺泡灌洗導(dǎo)管裝置和自制新型導(dǎo)管裝置進(jìn)行檢查。納入術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為周圍型肺癌者121例，男93例、女28例，年齡37～75歲，鱗癌82例、腺癌39例。其中，使用傳統(tǒng)灌洗裝置者74例(對(duì)照組)，男56例、女18例，年齡39～75歲，腺癌22例、鱗癌52例；使用自制新型灌洗裝置者47例(觀察組)，男37例、女10例，年齡37～72歲，腺癌17例、鱗癌30例。兩組性別、年齡及病理類型具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 BALF檢查及患者不適反應(yīng)觀察 按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(草案)》，使用傳統(tǒng)或自制新型支氣管肺泡灌洗導(dǎo)管裝置進(jìn)行檢查。檢查獲得的病理標(biāo)本部分用于LCT制片，部分凍存于液氮中以備PCR檢測(cè)。同時(shí)，記錄患者行BALF檢查過(guò)程中及檢查后出現(xiàn)的不適反應(yīng)。自制新型支氣管肺泡灌洗導(dǎo)管裝置，見(jiàn)圖1。

注：灌水口(1)，進(jìn)水導(dǎo)管(2)，出水孔(3)，吸水孔(4)，吸水導(dǎo)管(5)，回收口(6)，硅膠乳頭(7)，儲(chǔ)水倉(cāng)(8)，回收導(dǎo)管(9)，負(fù)壓導(dǎo)管(10)，負(fù)壓泵(11)，連接件(12)，注射器(13)；進(jìn)水導(dǎo)管(2)和吸水導(dǎo)管(5)在連接件(12)內(nèi)分別匯合成一支直徑為2 mm的總導(dǎo)管；吸水孔(4)的高度位于出水孔(3)的下側(cè)。

圖1 新型支氣管肺泡灌洗導(dǎo)管示意圖

1.3 LCT檢查 取部分BALF檢查獲得的病理標(biāo)本，離心后進(jìn)行LCT制片；以95%乙醇固定15 min，分別經(jīng)蘇木素和橙黃染液染色；脫水、透明后進(jìn)行封片，常規(guī)巴氏染色；由2位病理科醫(yī)師同時(shí)顯微鏡下拍照、閱片、判讀，并觀察制片細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。

1.4 TTF-1、p63 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time PCR法。取凍存于液氮中的剩余部分BALF，提取總RNA并定量；于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA產(chǎn)物為模板，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增目的基因片段。TTF-1上游引物5′-CGTTCTCAGTGTCTGACATCTTGA-3′，下游引物5′-CCTCCATGCCCACTTTCTTG-3′；p63上游引物5′-GGAAAACAATGCCCAGACTC-3′，下游引物5′-GCGCGTGGTCTGTGTTAAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′，下游引物5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，按95 ℃ 30 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s循環(huán)35次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析TTF-1和p63 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組BALF檢查不適反應(yīng)比較 觀察組未出現(xiàn)不適反應(yīng)；對(duì)照組出現(xiàn)不適反應(yīng)共6例(8.1%)，其中僅出現(xiàn)胸痛4例，兼有咳嗽、發(fā)熱、胸痛2例(其中1例發(fā)生出血)。觀察組不適反應(yīng)少于對(duì)照組(P=0.048)。

2.2 兩組LCT制片細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量、診斷肺癌及其分型的準(zhǔn)確性比較 觀察組細(xì)胞鋪片比較分散、均勻，腫瘤細(xì)胞很清楚；對(duì)照組多出現(xiàn)炎性細(xì)胞較多，分布不均勻，腫瘤細(xì)胞難以分辨。低倍鏡下(100×)，單視野觀察組腫瘤細(xì)胞數(shù)量為(76±12)個(gè)，高于對(duì)照組的(25±18)個(gè)(P=0.002)。觀察組檢出腺癌13例(76.5%)、鱗癌26例(86.7%)、總檢出率83.0%，對(duì)照組檢出腺癌14例(63.6%)、鱗癌31例(59.6%)、總檢出率60.8%，觀察組鱗癌、肺癌總檢出率均高于對(duì)照組(P均=0.010)。

2.3 兩組灌洗細(xì)胞中TTF-1、p63 mRNA表達(dá)水平對(duì)肺鱗癌和腺癌診斷價(jià)值的比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組灌洗細(xì)胞中TTF-1、p63 mRNA表達(dá)比較

注：與同組腺癌比較，*P<0.01。

ROC分析顯示，對(duì)照組以0.303為p63 mRNA診斷肺鱗癌的界值，其診斷靈敏度為0.860、特異度為0.873；以0.287為T(mén)TF-1 mRNA診斷肺腺癌的界值，其診斷靈敏度為0.873、特異度為0.808。觀察組以0.229為p63 mRNA診斷肺鱗癌的界值，其診斷靈敏度為0.921、特異度為0.915；以0.204為T(mén)TF-1 mRNA診斷肺腺癌的界值，其診斷靈敏度為0.880、特異度為0.903。與對(duì)照組比較，觀察組采集的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果兩指標(biāo)臨界值有所下調(diào)，但靈敏度和特異度均提高。

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，肺腺癌和鱗癌有明顯的致癌性突變和不同的治療反應(yīng)，這就推動(dòng)了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)精確的病理分型。例如，貝伐單抗禁用于鱗癌，這種藥物增加鱗癌患者的肺出血風(fēng)險(xiǎn)。肺癌分型已成為治療的關(guān)鍵，可指導(dǎo)個(gè)性化治療。目前，除在術(shù)后對(duì)手術(shù)切除病理組織進(jìn)行常規(guī)病理檢查作為病理分型的金標(biāo)準(zhǔn)外，臨床還有在術(shù)前對(duì)病理診斷的迫切需求。BALF檢查創(chuàng)傷輕微且不良并發(fā)癥較少，因而被廣泛應(yīng)用。

BALF是通過(guò)纖維支氣管鏡對(duì)支氣管以下肺段或亞肺段水平，反復(fù)以無(wú)菌生理鹽水灌洗、回收，對(duì)其進(jìn)行一系列檢測(cè)和分析，從而獲得下呼吸道病變的性質(zhì)特點(diǎn)和活動(dòng)程度，有助于明確診斷。傳統(tǒng)方式通過(guò)一根導(dǎo)管將生理鹽水注入人的支氣管肺泡內(nèi)，通過(guò)內(nèi)腔鏡觀察水位，當(dāng)支氣管肺泡充滿水后才能進(jìn)行回收，因此易造成患者嗆水咳嗽以及回收不充分；該操作必須大量灌入生理鹽水，因此對(duì)醫(yī)師的技術(shù)要求特別高；而且，充水后生理鹽水會(huì)流向其他地方，回收的生理鹽水也有被其他地方污染的情況，無(wú)法進(jìn)行精確的病理查找。

本研究應(yīng)用擁有實(shí)用新型發(fā)明專利的自制新型灌洗導(dǎo)管裝置，目的在于解決現(xiàn)有裝置在應(yīng)用中易出現(xiàn)的問(wèn)題。該裝置有進(jìn)水導(dǎo)管，其頂端開(kāi)有灌水口，灌水口上接通有注射器；進(jìn)水導(dǎo)管的端部固定安裝在連接件的內(nèi)腔中，連接件的內(nèi)腔中還設(shè)有吸水導(dǎo)管；吸水導(dǎo)管的頂端設(shè)有回收口，回收口的頂端螺紋連接有回收導(dǎo)管；回收導(dǎo)管的端部延伸至儲(chǔ)水倉(cāng)的內(nèi)腔中，儲(chǔ)水倉(cāng)的內(nèi)腔中還插接有負(fù)壓導(dǎo)管；所述進(jìn)水導(dǎo)管和吸水導(dǎo)管在連接件內(nèi)分別匯合成一支總導(dǎo)管(直徑2 mm)，其底端密封套接有硅膠乳頭；硅膠乳頭的一側(cè)開(kāi)有出水孔，另一側(cè)開(kāi)有吸水孔，且吸水孔的高度位于出水孔的下側(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該裝置中直徑2 mm的總導(dǎo)管插入時(shí)，人體的不適感減弱；硅膠乳頭的設(shè)置，防止主導(dǎo)管的端部對(duì)肺泡造成傷害；回收導(dǎo)管將人體肺泡內(nèi)的積水抽出，暫經(jīng)過(guò)儲(chǔ)水倉(cāng)儲(chǔ)存；控制負(fù)壓泵工作，通過(guò)負(fù)壓導(dǎo)管將儲(chǔ)水倉(cāng)內(nèi)的積水抽出，從而避免回收不充分。本研究結(jié)果顯示，觀察組未引起不適反應(yīng)，大大提高了BALF檢查灌洗的效率；所收集的細(xì)胞標(biāo)本制片后，細(xì)胞鋪片比較分散、均勻，腫瘤細(xì)胞很清楚，鏡下視野中腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著增多；而對(duì)照組所獲細(xì)胞樣本制片后出現(xiàn)炎性細(xì)胞太多、分布不均勻、腫瘤細(xì)胞難以辨別等情況，可見(jiàn)新型裝置所得灌洗細(xì)胞質(zhì)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)裝置。并且，應(yīng)用不同裝置采集的病理標(biāo)本進(jìn)行LCT制片，新型裝置采集的標(biāo)本肺癌檢出率更高。

研究表明，肺腺癌和鱗癌幾乎不重疊共表達(dá)TTF-1和p63[11，12]。因此，本研究以二者作為判定周圍型肺癌病理分型的標(biāo)志物，在灌洗細(xì)胞樣本中采用Real-time PCR法對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明二者在腺癌和鱗癌兩種病理分型中呈現(xiàn)明顯的分化表達(dá)趨勢(shì)；以表達(dá)水平對(duì)肺腺癌和鱗癌兩種病理分型進(jìn)行診斷，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用新型裝置采集的灌洗細(xì)胞樣本檢測(cè)分子指標(biāo)的表達(dá)水平進(jìn)行診斷，可明顯提高診斷的靈敏度和特異度，診斷價(jià)值優(yōu)于傳統(tǒng)灌洗裝置。

綜上所述，本研究表明自制新型支氣管肺泡灌洗導(dǎo)管裝置用于BALF檢查，可以有效降低灌洗過(guò)程中患者的不適感，提高了灌洗的效率，采集到的灌洗細(xì)胞樣本質(zhì)量好，用于分子標(biāo)志物表達(dá)水平檢測(cè)進(jìn)行肺癌分型時(shí)具有更好的診斷價(jià)值，適宜在臨床推廣應(yīng)用。