啤酒糟制備低聚木糖功能飼料添加劑酶解條件優(yōu)化

鄧元元， 胡 超， 陳思宇， 朱文娟， 王 剛， 蘭時(shí)樂

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128）

啤酒糟含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及鈣、磷、鐵、銅、錳礦物質(zhì)元素 （肖連東等，2008；Mussato等，2005）。近年來，在用啤酒糟代替部分棉籽殼、麥麩栽培食用菌（葉春苗，2016、2015）及發(fā)酵啤酒糟替代豆粕進(jìn)行水產(chǎn)（李小霞等，2016）、肉鵝（姬向波等，2015）、肉鴨（王彥茹等，2016）、育肥奶公牛養(yǎng)殖（周永平，2016）等方面開展了大量的研究，并取得了一定的研究成果，但由于啤酒糟中纖維素含量較高，且容易腐敗，限制了其在飼料工業(yè)中應(yīng)用。

低聚木糖是一種具有獨(dú)特生理活性的功能性低聚糖，能促進(jìn)動物腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌大量增殖（Zhao等，2015），抑制腐敗菌的生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫力 （范程瑞等，2017；王曉華，2015）。同時(shí)，低聚木糖還具有清除體內(nèi)自由基、抗衰老的功效 （Bian 等，2013；Ayyappan Appukuttan Aachary等，2011）。據(jù)測定，啤酒糟中半纖維素含量為 21.01% ～31.5%（劉甜甜，2013；鄧啟華等，2008），在適宜的工藝條件下可降解成低聚木糖。因此，本試驗(yàn)以啤酒糟為原料，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化啤酒糟酶解制備含低聚木糖啤酒糟飼料添加劑的試驗(yàn)參數(shù)，以期為啤酒糟的深度開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 啤酒糟 將購于英博雪津湖南（白沙）啤酒有限公司新鮮啤酒糟置于80℃恒溫條件下烘干至恒重，粉碎至60～80目。

1.1.2 主要試劑 木二糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），木三糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），木四糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%），木五糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度96%），購于青島博智匯力生物科技有限公司；碳酸鈉、雙氧水、氫氧化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國，Merck 公司）；高純氮（純度99%，長沙高科技?xì)怏w有限公司）；纖維素酶、木聚糖酶（湖南利爾康生物股份有限公司。其中纖維素酶10000 U/g，木聚糖酶 100000 U/g）。

1.1.3 主要儀器 色譜柱：COSMOSIL Sugar-D糖分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國，WATERS）；蒸發(fā)光散色檢測器（ELSD，美國，WATERS）；電子分析天平（KF3102，浙江凱豐集團(tuán)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（CR21G，無錫凱派克斯科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 啤酒糟的預(yù)處理 稱取100 g粉碎的啤酒糟，用自來水調(diào)節(jié)固液比為1∶5，按質(zhì)量比加入0.7%的碳酸鈉和0.1%的雙氧水，在115℃條件下處理30 min。

1.2.2 酶解條件篩選 采用單因素試驗(yàn)研究酶種類、酶添加量、酶解初始pH、酶解溫度、酶解時(shí)間等對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

1.2.3 啤酒糟酶解工藝條件響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Design-Expert.8.0.6b軟件，根據(jù)BOX-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理（王永菲等，2005），選取起始pH、木聚糖酶量、纖維素酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間等條件對低聚木糖含量影響較大的因素，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表

1.2.4 低聚木糖產(chǎn)量的測定 稱取適量的經(jīng)酶解且80℃干燥后的啤酒糟，加入10倍體積的蒸餾水，30℃，180 r/min條件下振蕩提取 30 min，4000 r/min、4℃條件下離心15 min，收集上清液并定容至100 mL，采用HPLC-ELSD法測定啤酒糟中低聚木糖的含量。HLPC-ELSD法測定條件為：色譜柱：COSMOSIL Sugar-D糖分析柱 （250mm×4.6mm，5 μm）； 流動相為乙腈-水（69：31，V/V）；流速：0.9 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：3 μL；蒸發(fā)溫度：78℃；載氣流速：1.6L/min；載氣壓力：0.5MP。

表2 纖維素酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表3 木聚糖酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表4 混合酶對低聚木糖產(chǎn)量的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在經(jīng)預(yù)處理的啤酒糟中加入100、150、200、250、300、350 U/g 的纖維素酶，攪拌均勻，45℃、pH 5.0條件下酶解2.5 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表2。

從表2結(jié)果可知，隨著纖維素酶添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量也隨之增加。當(dāng)纖維素酶添加量為300 U/g時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量最高，為18.8721 mg/g。但纖維素酶添加量繼續(xù)增加，低聚木糖產(chǎn)量反而下降。由于纖維素酶添加量為250 U/g和300 U/g時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量差異不顯著，故選擇纖維素酶的添加量為250 U/g進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 木聚糖酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響在經(jīng)過預(yù)處理的啤酒糟中按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別加入 100、150、200、250、300、350 U/g 的木聚糖酶，攪拌均勻，50℃、pH 4.8條件下酶解3 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果可知，當(dāng)木聚糖酶添加量為200 U/g時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量達(dá)19.1448 mg/g。隨著木聚糖酶添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量下降。

2.3 混合酶對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在經(jīng)過預(yù)處理的啤酒糟中分別加入由纖維素酶和木聚糖酶組成的混合酶，攪拌均勻，50℃、pH 5.0條件下酶解3 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表4。

表4結(jié)果表明，不同木聚糖酶和纖維素酶混合酶處理啤酒糟，低聚木糖產(chǎn)量差異較大。 當(dāng)纖維素酶和木聚糖酶以250 U/g和200 U/g組成混合酶時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量最高，為21.1002 mg/g。

2.4 起始pH對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在混合酶試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，分別調(diào)節(jié)預(yù)處理后的啤酒糟pH 分別為 3.5、4.0、4.5、 5.0、5.5、6.0，50 ℃條件下酶解3 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表5。

由表5結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著預(yù)處理后的啤酒糟初始pH的升高，低聚木糖的產(chǎn)量也隨之增加。當(dāng)初始pH為5.5時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量達(dá)20.8721 mg/g。

2.5 酶解溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，分別將酶解溫度設(shè)置為35、40、45、50、55、60℃，酶解3 h后測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表6。

溫度是影響酶解效果的主要因素之一。酶促反應(yīng)速度在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度的增高而加快，但當(dāng)酶解溫度超過最適酶解溫度，酶促反應(yīng)速率下降。從表6可以看出，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量最大，為22.4692 mg/g。

2.6 酶解時(shí)間對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，將預(yù)處理后的啤酒糟分別酶解1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 后測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表7。

由表7結(jié)果可知，隨著酶解時(shí)間的延長，低聚木糖產(chǎn)量也隨之提高。當(dāng)酶解時(shí)間為3 h時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量達(dá)到22.5649 mg/g；但酶解時(shí)間延長，低聚木糖產(chǎn)量下降。原因可能為隨著酶解時(shí)間的延長，低聚木糖進(jìn)一步被水解成木糖。

2.7 酶解工藝條件響應(yīng)面優(yōu)化

2.7.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解工藝中低聚木糖產(chǎn)量影響較大的5個(gè)因素，即起始pH、木聚糖酶酶量、纖維素酶酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間，采用Design-Expert.8.0.6b軟件，根據(jù)BOX-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對酶解工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表8。

根據(jù)表8 BOX-Benhnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，采用Design-Expert.8.0.6b軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表9。

由表9結(jié)果可知，pH、纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間均是顯著影響低聚木糖產(chǎn)量的主要因素。BC、BE、DE的P值均小于0.05，說明木聚糖酶添加量和纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量和酶解溫度、酶解溫度和酶解時(shí)間之間的交互作用顯著。

采用Design-Expert.8.0.6b軟件對結(jié)果進(jìn)行可信度分析，結(jié)果如表10。

方差分析結(jié)果表明（表9和表10），模型的F值和失擬項(xiàng)分別為20.78和2.25，P值＜0.0001和失擬項(xiàng)較高（0.1463＞0.05），說明模型與實(shí)際情況擬合度良好。

根據(jù)響應(yīng)面系數(shù)的回歸分析，獲得該模型擬合方程為：Y=23.44-0.72A-0.045B-0.25C-1.26D+0.40E-0.39AB+0.48AC-0.63AD+1.11AE-1.45BC+0.66BD+0.90BE-0.35CD+0.64CE+0.72DE-1.59A2-1.73B2-2.19C2-3.17D2-2.14E2。

該回歸方程的 R2=0.9433，RAdj2=0.8979，CV/%=3.33%，SNR=17.318，說明模型可信度較高，且方程具有較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7.2 響應(yīng)面分析 基于上述回歸方程，繪制起始pH，木聚糖酶酶量，纖維素酶酶量，酶解溫度，酶解時(shí)間之間交互作用的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖。結(jié)果分別見圖1～圖10。

表5 初始pH對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表6 酶解溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表7 酶解時(shí)間對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表8 BOX-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表9 響應(yīng)面結(jié)果方差分析

表10 二次回歸方程的方差分析

等高線的形狀可以反映出因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素不顯著，而橢圓則表示較為顯著（毋銳琴等，2008）。由圖1可以看出，隨著木聚糖添加量的增加和pH提高，低聚木糖產(chǎn)量先緩慢增加后緩慢下降，且等高線呈圓形，說明木聚糖酶添加量與pH之間交互作用不顯著。當(dāng)木聚糖酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí)，纖維素酶添加量與初始pH的交互作用見圖2。由圖2可以看出，隨著纖維素酶添加量的增加和初始pH的提高，低聚木糖產(chǎn)量先上升后下降，說明纖維素酶添加量與初始pH之間存在顯著的交互作用。當(dāng)木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí)，起始pH與酶解溫度的交互作用見圖3。從圖3可以看出，隨著起始pH與酶解溫度的提高，低聚木糖產(chǎn)量呈先上升后下降，且酶解溫度超過51℃時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量迅速下降，說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有極顯著的影響。當(dāng)木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時(shí)，初始pH與酶解時(shí)間的交互作用見圖4。由圖4可知，隨著初始pH的升高，低聚木糖產(chǎn)量下降明顯；而低聚木糖產(chǎn)量隨酶解時(shí)間的延長而增加，但酶解時(shí)間超過3.3 h，產(chǎn)量下降，說明二者存在較為顯著的交互作用。當(dāng)初始pH、酶解溫度和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí)，纖維素酶添加量和木聚糖酶添加量的交互作用見圖5。由圖5可知，低聚木糖產(chǎn)量隨兩種酶添加量的增加而增加，但當(dāng)纖維素酶添加量和木聚糖酶添加量分別接近350 U/g和250 U/g，低聚木糖產(chǎn)量有所下降，說明兩種酶對低聚木糖產(chǎn)量有顯著的影響。當(dāng)初始pH、纖維素酶添加量和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí)，木聚糖酶添加量與酶解溫度的交互作用見圖6。圖6結(jié)果表明，隨著酶解溫度的升高，低聚木糖產(chǎn)量先升后降，而低聚木糖產(chǎn)量隨木聚糖酶添加量的增加先略升后略降，且等高線形狀呈橢圓，說明兩者之間的交互作用顯著。當(dāng)初始pH、纖維素酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時(shí)，木聚糖酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用見圖7。從圖7可知，隨著木聚糖酶添加量的增加和酶解時(shí)間的延長，低聚木糖產(chǎn)量先上升后下降，說明維素酶添加量和酶解溫度存在顯著的交互作用。當(dāng)初始pH、木聚糖酶添加量和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí)，纖維素酶添加量與酶解溫度的交互作用見圖8。由圖8可知，低聚木糖產(chǎn)量隨纖維素酶添加量增加與酶解溫度的升高先升高后下降，說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有顯著影響，二者交互作用形成的曲面為拋物面，也說明纖維素酶添加量與酶解溫度存在交互作用。當(dāng)初始pH、木聚糖酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時(shí)，纖維素酶添加量與酶解時(shí)間的交互作用見圖9。圖9結(jié)果表明，低聚木糖產(chǎn)量隨纖維素酶添加量的增加和酶解時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有顯著影響。當(dāng)初始pH、木聚糖酶添加量和纖維素酶添加量處于最佳水平時(shí)，酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用見圖10。由圖10可以看出，酶解溫度和酶解時(shí)間交互作用顯著。

圖1 起始pH與木聚糖酶酶量對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖2 起始pH與纖維素酶酶量對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖3 起始pH與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖4 起始pH與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖5 木聚糖酶酶量與纖維素酶酶量對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖6 木聚糖酶酶量與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖7 木聚糖酶酶量與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖8 纖維素酶酶量與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖9 纖維素酶酶量與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖10 酶解溫度與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

由Design-Expert.8.0.5b軟件可求出回歸模型極值點(diǎn)，即適宜酶解條件：起始pH 5.4917，木聚糖酶添加量201.2607 U/g，纖維素酶添加量248.6930 U/g，酶解溫度48.1765℃，酶解時(shí)間3.0925 h。優(yōu)化得到低聚木糖的產(chǎn)量預(yù)測值為23.7647 mg/g。為了驗(yàn)證本試驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測值的準(zhǔn)確性和可操作性，調(diào)整酶解條件為：起始pH 5.5，木聚糖酶添加量201 U/g，纖維素酶添加量248 U/g，酶解溫度48℃，酶解時(shí)間3 h。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，低聚木糖的平均產(chǎn)量為23.8673 mg/g，與預(yù)測值接近，說明此模型能準(zhǔn)確預(yù)測低聚木糖的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

啤酒糟制備低聚木糖飼料添加劑的工藝為：酶解起始pH 5.5，木聚糖酶添加量201 U/g，纖維素酶添加量248 U/g，酶解溫度48℃，酶解時(shí)間3 h。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，測得啤酒糟中低聚木糖的平均含量為23.8673 mg/g，與理論值相對誤差僅為0.43%，說明采用響應(yīng)面分析法對利用啤酒糟制備含低聚木糖飼料添加劑酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化是有效的。