脆性X綜合征國家參考品的研制

高飛，胡澤斌，游延軍，蒲小聰，陳蕊，黃杰

脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是引起遺傳性智力低下和孤獨(dú)癥譜系障礙最常見的單基因病[1]，95% 以上的脆性 X 綜合征患者是由于FMR1 基因 5' 非編碼區(qū) CGG 重復(fù)序列擴(kuò)增導(dǎo)致 Fmrp 表達(dá)沉默所致[2]，CGG 重復(fù)在人群中具有高度多態(tài)性，正常型的重復(fù)次數(shù)為 6～44，F(xiàn)MR1基因表達(dá)正常，無明顯臨床表現(xiàn)。中間型的重復(fù)次數(shù)為 45～54，子代可擴(kuò)增為前突變，無明顯臨床表現(xiàn)。CGG 重復(fù)數(shù)突變至 55～200 的個體稱為前突變攜帶者（premutation，PM），全突變（full mutation，F(xiàn)M）重復(fù) 次數(shù)大于 200[3]，臨床表現(xiàn)明顯。1995年至今，我國共對 12 676 例智力低下患兒進(jìn)行了脆性 X 綜合征的篩查，查出患兒共計 804 例，以此計算出脆性 X 綜合征在我國智力低下患兒中的患病率約為 6.3%[4]。2006年國內(nèi)共對 850 例孤獨(dú)癥譜系障礙患兒進(jìn)行篩查，檢出 19 例脆性 X 綜合征患兒，估算出脆性 X 綜合征在孤獨(dú)癥譜系障礙中的患病率約為 2.2%[5]。

目前，國內(nèi)外許多廠家已開發(fā)脆性 X 綜合征檢測試劑盒，用以檢測患者的FMR1 基因 CGG 突變型別，由于方法不同[6]，其特異性和靈敏度存在差別。因此，有必要研制脆性 X 定性參考品使檢測規(guī)范化。

1 材料與方法

1.1 材料

核酸提取試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；脆性 X 參考品研制所需的細(xì)胞系包含的基因型別：中間型（CGG 重復(fù) 45～54）、前突變型（CGG 重復(fù) 55～200）、全突變型（CGG 重復(fù) ＞ 200）、嵌合型（前突變與全突變嵌合存在）、嵌合型（野生與前突變嵌合存在）、罕見FMR1 基因缺失型及 6 個野生型（正常人樣本）均購自中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室；陰性參考品研制所需原料為收集其他病原體感染的細(xì)胞；參考品驗證所需試劑盒購自廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司和北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 參考品原料的制備 當(dāng)天采集患者 5～10 ml 新鮮血液樣品，使用一次性枸櫞酸鈉抗凝采血管保存，低溫保存運(yùn)輸至實驗室。在無菌環(huán)境中，提取患者的外周血單核淋巴細(xì)胞，加入病毒液制備完全轉(zhuǎn)化液，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化與細(xì)胞培養(yǎng)、凍存。建立細(xì)胞系后進(jìn)行種子細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)。用核酸提取試劑盒對各型別細(xì)胞系進(jìn)行 DNA 抽提，用 NanoDorp 測定OD260/OD280和OD260/OD230值和瓊脂糖凝膠電泳膠檢驗 DNA 的完整性，NanoDropTMOne 對 DNA 進(jìn)行精確 定量。陽性參考品為：中間型、前突變型、全突變型、嵌合型（前突變與全突變嵌合存在）、嵌合型（野生與前突變嵌合存在），陰性參考品原料的來源為收集其他非人源性大腸桿菌，提取核酸，與罕見FMR1 基因缺失型及 6 個野生型組成陰性參考品。

1.2.2 參考品原料的驗證 由中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室對參考品所包含的陽性及陰性樣本的 DNA 進(jìn)行濃度測定。同時，將全部樣本送中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室進(jìn)行毛細(xì)管電泳及 DNA 片段分析。

1.2.3 參考品盤的制備 將 21 個樣本的基因組 DNA 溶液稀釋至 50 ng/μl 的濃度，然后將稀釋后的 DNA 溶液分裝在 0.5 ml 的凍存管中。每套參考品盤包含 21 個樣本，其中，陽性樣本包括：2 種中間型樣本（CGG 重復(fù) 45～54）、4 種前突變型（CGG 重復(fù) 55～200）、4 種全突變型（CGG 重復(fù) ＞ 200）、1 種嵌合型（前突變與全突變嵌合存在）、1 種嵌合型（野生與前突變嵌合存在），陰性樣本 包括：1 種罕見FMR1 基因缺失型及 6 種野生型樣本、 2 種非人源樣本（大腸桿菌核酸樣本）。參考品盤放置于 -80 ℃ 保存。

1.2.4 參考品盤的分裝后驗證 采用由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 檢測試劑盒對分裝參考品進(jìn)行驗證。檢測結(jié)果與樣本信息 一致。

1.2.5 不同公司對參考品盤的驗證 選擇 4 家脆性 X 綜合征檢測試劑盒檢測、生產(chǎn)或代理機(jī)構(gòu)對本參考品進(jìn)行驗證。此 4 家單位生產(chǎn)的試劑的檢測方法包括：PCR-熒光法、DNA 片段分析法、毛細(xì)管電泳法等。驗證的項目包括以下幾個方面：①準(zhǔn)確性（陽性符合率）：檢測試劑盒檢測范圍內(nèi)脆性 X 不同型別國家參考品；②特異性：檢測 9 份陰性參考品。

1.2.6 參考品穩(wěn)定性驗證 將參考品反復(fù)凍融 3 次后，采用廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供的脆性 X 綜合征FMR1 基因檢測試劑盒（熒光 PCR 毛細(xì)管電泳法）進(jìn)行穩(wěn)定性驗證。

2 結(jié)果

2.1 參考品原料的驗證結(jié)果

將參考品所包含的陽性及陰性 DNA 樣本送中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室進(jìn)行毛細(xì)管電泳及 DNA 片段分析。用 GeneMapper 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，分析結(jié)果顯示全部陽性樣本及 1 種罕見FMR1 基因缺失型及 6 種野生 型樣本的堿基序列與樣本 CGG 重復(fù)數(shù)一致。檢測結(jié)果見 圖1、表1。

2.2 參考品盤的分裝后驗證結(jié)果

圖1 樣本毛細(xì)管電泳驗證結(jié)果

表1 樣本基因片段分析驗證結(jié)果

圖2 AmplideXTM FMR1 PCR/CE Reagents 檢測試劑盒對分裝參考品的驗證結(jié)果

采用北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 檢測試劑盒對分裝參考品進(jìn)行驗證。驗證結(jié)果顯示參考品盤中的 P1、P2 樣本為脆性 X 綜合征FMR1 基因中間型樣本 CGG 重復(fù)數(shù)分別為 46/Y、54/Y，P3～P6 為脆性 X 綜合征FMR1 基因前突變型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)分別為：30/69、29/155、56/Y、100/Y，P7～P10 為脆性 X 綜合征FMR1 基因全突變型樣 本，CGG 重復(fù)數(shù)分別為：30/ ＞ 200、29/ ＞ 200、＞ 200/Y、＞ 200/Y，P11 為脆性 X 綜合征FMR1 基因前突變和全突變嵌合型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)為：86 ＞ 200/Y，P12 為脆性 X 綜合征FMR1 基因野生和全突變嵌合型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)為：13 ＞ 200/Y，N1～N6 為FMR1 基因野生型樣本，CGG 重復(fù)數(shù)分別為：29/29、31/36、29/30、30/34、30/Y、36/Y，N7～N8 為非人源性基因組 DNA 樣本，N9 為FMR1 基因缺失樣本，驗證結(jié)果見圖2。

2.3 不同公司對參考品盤的驗證

4 家脆性 X 綜合征檢測試劑盒檢測、生產(chǎn)或代理機(jī)構(gòu)用其自行生產(chǎn)或代理的脆性 X 綜合征檢測試劑盒對本參考品進(jìn)行驗證。驗證結(jié)果表明參考品的組成成分合格，驗證結(jié)果見表2。

表2 4 家公司對本參考品盤驗證結(jié)果

表3 參考品的穩(wěn)定性驗證結(jié)果

2.4 參考品的穩(wěn)定性驗證結(jié)果

將參考品反復(fù)凍融 3 次后，采用北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司提供的 AmplideXTMFMR1 PCR/CE Reagents 檢測試劑盒進(jìn)行穩(wěn)定性驗證。驗證結(jié)果表明反復(fù)凍融對本參考品的穩(wěn)定性沒有影響，如表3所示。

3 討論

目前脆性 X 的基因診斷技術(shù)主要有 PCR、Southern blot、DNA 片段分析、BSP-測序等方法，已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外各大醫(yī)院和臨檢機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床診斷。然而目前在脆性 XFMR1 基因檢測中，無論中間型、前突變還是全突變脆性 X 突變型別，國內(nèi)外都缺乏統(tǒng)一認(rèn)可的國家參考品。脆性 X 綜合征國家參考品涵蓋了國內(nèi)常見脆性 X 突變型別和國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)但頻率低于 1% 的部分低頻型別樣本。通過對脆性 X 綜合征國家參考品的驗證，結(jié)果表明參考品性質(zhì)穩(wěn)定，可以為臨床實驗室質(zhì)量評價提供可靠的參考物質(zhì)，可用于國內(nèi)大多數(shù)試劑盒的性能評價要求。因此，該參考品盤能基本滿足不同試劑盒的評價。根據(jù)美國國家脆性 X 基金會的研究，脆性 XFMR1 基因型別包含：野生型、中間型、前突變型、全突變型和嵌合型，本研究建立了包含全部 5 種不同型別的脆性 X 綜合征國家參考品，為臨床實驗室質(zhì)量評價及相關(guān)試劑盒的研發(fā)提供了可靠的質(zhì)控物質(zhì)。