正交法優(yōu)化ZnO/MMT抗菌材料制備條件及抑菌活性研究

麻曉霞，高靈娟，馬玉龍，翟喜會(huì)，楊青萍，馬春香

(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

1 引 言

微生物細(xì)菌污染對(duì)飼料、食品、牲畜和人類健康造成了危害，尤其是存在于食品、飼料中的病原菌，如沙門氏菌(Salmonella)，大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)等已成為畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展及公共衛(wèi)生安全的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象[1]。許多動(dòng)物會(huì)被感染且垂直傳播，并伴有交叉污染情況[2]；而大量使用抗生素會(huì)使其產(chǎn)生耐藥性，也給耐藥病原菌防治帶來(lái)新的問(wèn)題。近年來(lái)，抗菌材料以其應(yīng)用范圍廣、安全性高、有效期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，可以有效降低細(xì)菌的交叉?zhèn)魅綶3]。

基于納米氧化鋅良好的抗菌活性[4]，若將氧化鋅負(fù)載于具有特殊功能的載體上不僅可以保持抗菌劑固有的特性、增強(qiáng)其穩(wěn)定性，還有利于回收和重復(fù)使用，降低成本，增加其抗微生物功效的持續(xù)時(shí)間。常見(jiàn)抗菌材料的載體主要有沸石類、蒙脫石類、硅膠類以及磷酸鹽類等[5]。蒙脫石(montmorillonite，MMT)是一種硅鋁酸鹽礦物，有良好的離子交換性、吸附性和膨脹性[6]，在動(dòng)物飼糧中適量添加MMT，能維護(hù)家禽腸道屏障功能，改善腸道健康，加快禽畜生長(zhǎng)[7]。筆者通過(guò)正交試驗(yàn)制備蒙脫石負(fù)載氧化鋅抗菌材料，探究ZnO/MMT抗菌材料制備條件的影響因素，并對(duì)所選菌種進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，為動(dòng)物疾病預(yù)防和治療提供參考。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 材 料

粗鈣基蒙脫石(97%)，購(gòu)于內(nèi)蒙古赤峰市和明生化工有限公司；鋅試劑、氯化鋅和氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；沙門氏菌(ATCC 14028)、大腸桿菌(ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)均購(gòu)于國(guó)家微生物保藏中心。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用反應(yīng)物物料配比(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8)、反應(yīng)溫度(70 ℃，80 ℃，90 ℃，100 ℃)和反應(yīng)時(shí)間為(18 h，24 h，30 h，36 h)為抗菌材料制備條件。以反應(yīng)物物料配比(因素A)、反應(yīng)溫度(因素B)、反應(yīng)時(shí)間(因素C)為考察因素，每個(gè)因素以最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)為實(shí)驗(yàn)研究指標(biāo)，采用L16(45)設(shè)計(jì)正交表，ZnO/MMT抗菌材料制備因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in the orthogonal experiment designs

2.3 ZnO/MMT抗菌材料的制備

取粗品鈣基蒙脫石，加去離子水，攪拌1 h，靜置3 h，棄上清液和底部雜質(zhì)，重復(fù)上述操作3～5次，收集懸浮液，離心分離，所得固體于70 ℃下干燥，研磨粉碎后過(guò)300目標(biāo)準(zhǔn)篩，即得蒙脫石純品(MMT)。

取一定量氯化鋅和氫氧化鈉溶于去離子水中，水浴恒溫振蕩，加入蒙脫石純品，攪拌后離心分離，去離子水洗滌3次，過(guò)夜干燥，125 ℃煅燒2 h，粉碎后過(guò)300目標(biāo)準(zhǔn)篩，即得載氧化鋅蒙脫石抗菌材料(ZnO/MMT)。

2.4 抗菌材料的表征

使用X射線衍射儀(XRD，Bruker D8)獲得材料晶體結(jié)構(gòu)性質(zhì)，X射線源為Cu Kα輻射。利用N2物理吸附儀(BET，JW-BK132F)測(cè)定樣品的孔結(jié)構(gòu)特征。采用掃描電子顯微鏡(SEM，JSM-7500F)觀察樣品改性前后結(jié)構(gòu)形貌變化及團(tuán)聚情況。

2.5 抗菌材料MIC及MBC的測(cè)定

取不同濃度梯度的抗菌材料及提純MMT于試管中，加適量稀釋后菌種、液體培養(yǎng)基，混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，將未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)濃度記為材料的最小抑菌濃度(MIC)。從未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中取少量上層溶液至已凝固的固體培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基上未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)或者菌落數(shù)小于5的濃度記為材料的最小殺菌濃度(MBC)。

2.6 抑菌圈法對(duì)抗菌材料抑菌性能的測(cè)定

移取100 μL二代菌懸液于無(wú)菌固體培養(yǎng)基中，涂布均勻，放入直徑為1 cm的無(wú)菌壓片，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，用直尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑(不包括壓片)。以MMT為陰性對(duì)照進(jìn)行空白試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 極差分析法

以沙門氏菌為試驗(yàn)菌種，MIC和MBC為測(cè)試指標(biāo)，極差分析[8]該抗菌材料的抑菌性能。由表2可知，物料配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)MIC的影響程度依次為RB>RA>RC。同理，運(yùn)用極差分析法計(jì)算了MBC對(duì)應(yīng)的RA、RB、RC依次為0.512、1.024、0.448，顯著性與MIC一致。

表2 抗菌材料對(duì)沙門氏菌的MIC和MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 MIC and MBC of antibacterial materials against Salmonella

3.2 方差分析法

方差分析法是一種利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定因素影響顯著性差異的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)[9]。以MIC研究指標(biāo)進(jìn)行方差分析(如表3所示)。物料配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)抗菌材料MIC影響的顯著性依次為B>A>C，方差分析結(jié)論與極差分析結(jié)果一致。以MIC為研究指標(biāo)，根據(jù)最優(yōu)水平組合的優(yōu)選原則[10]確定最優(yōu)制備條件為實(shí)驗(yàn)組合A4B1C1，即氯化鋅與氫氧化鈉比為1∶8，反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為18 h。采用鋅試劑分光光度法檢測(cè)了最優(yōu)條件下所制備ZnO/MMT的中Zn的負(fù)載量為6.14wt%。

表3 MIC方差分析結(jié)果Table 3 MIC analysis of variance results

3.3 材料測(cè)試分析

圖1為MMT和不同溫度下ZnO-MMT復(fù)合抗菌材料的XRD圖譜。由圖1可知，MMT的對(duì)應(yīng)晶面(001)在衍射角為5.9°時(shí)，其晶面間距為1.49 nm，屬鈣型蒙脫石。MMT負(fù)載ZnO后，特征衍射峰未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明負(fù)載后的MMT仍為鈣型蒙脫石。根據(jù)JCPDS卡片對(duì)比，在31.7°、34.4°、36.2°左右均發(fā)現(xiàn)有ZnO晶體(100)、(002)和(101)的晶面衍射，說(shuō)明在蒙脫石表面或內(nèi)部有ZnO生成，這與文獻(xiàn)[11]的測(cè)定結(jié)果相符。隨著反應(yīng)溫度的升高，ZnO晶體的衍射角和晶面間距基本不變，但衍射峰強(qiáng)度發(fā)生變化，且在70 ℃時(shí)強(qiáng)度最大，說(shuō)明70 ℃時(shí)ZnO/MMT復(fù)合抗菌材料中ZnO晶體數(shù)量最多。晶相分析表明：ZnO在蒙脫石表面或內(nèi)部生成，與蒙脫石載體表面牢固結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，二者存在著較強(qiáng)的界面關(guān)系。

圖1 MMT and ZnO/MMT的X射線衍射圖Fig.1 XRD patterns of MMT and ZnO/MMT samples

研究了不同溫度該抗菌材料的比表面積、孔體積及孔徑分布(表4)。與MMT相比， ZnO/MMT的孔體積增大，孔徑減小，這可能是由于ZnO微粒堆積形成小孔，使材料孔體積變大，微粒吸附于MMT孔道內(nèi)導(dǎo)致材料孔徑變小所致[12]。在70 ℃時(shí)，ZnO/MMT比表面積為53.7534 m2/g，較80、90和100 ℃條件下制備的ZnO/MMT的比表面積大很多，且孔徑最小，說(shuō)明隨著反應(yīng)溫度的升高，ZnO微?？赡馨l(fā)生了團(tuán)聚，導(dǎo)致孔徑變大，孔體積變小。負(fù)載ZnO前后蒙脫石孔結(jié)構(gòu)的變化顯示ZnO在蒙脫石表面或內(nèi)部均有生成，這與XRD表征的結(jié)果一致。

表4 材料的比表面積孔體積和孔徑Table 4 Specific surface area, pore volume and pore size of materials

圖2 MMT(a)和ZnO/MMT(b-e)復(fù)合抗菌材料和的SEM圖Fig.2 SEM images of MMT (a) and ZnO/MMT (b-e) composite antibacterial materials

圖2a-e分別為載體MMT和制備溫度為70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃下ZnO/MMT復(fù)合抗菌材料的SEM圖。由圖2a可知蒙脫石載體形貌呈片層結(jié)構(gòu)。在70 ℃時(shí)，ZnO晶體以針狀和棒狀的形態(tài)吸附在MMT片層表面及空隙中，較為疏松(圖2b)。升高溫度，ZnO晶體的形貌特征不再明顯，空隙消失，發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象(圖2c-e)。這可能由于煅燒溫度調(diào)控了納米氧化鋅顆粒的粒徑，使其表面能高、表面張力大，從而使納米氧化鋅顆粒團(tuán)聚[13]。

3.4 ZnO/MMT的廣譜抑菌活性

廣譜活性是評(píng)價(jià)抗菌材料的重要依據(jù)之一。因此，研究了最優(yōu)制備條件下ZnO/MMT復(fù)合抗菌材料對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果，見(jiàn)圖3所示。作為陰性對(duì)照，MMT對(duì)這三種菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，而ZnO/MMT復(fù)合材料對(duì)三個(gè)菌種均發(fā)現(xiàn)明顯的抑菌圈，說(shuō)明該條件下制備的ZnO/MMT對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均具有廣譜抑制效果，其抗菌機(jī)理可能是復(fù)合材料細(xì)菌直接相互作用，引起細(xì)菌表面損傷，繼而導(dǎo)致菌膜破裂最終引發(fā)細(xì)菌死亡[14]，抗菌機(jī)理的深入研究還在進(jìn)行中。

同時(shí)，還研究了該材料對(duì)三個(gè)菌種的MIC和MBC。由表5可知，ZnO/MMT對(duì)各試驗(yàn)菌株均表現(xiàn)出一定程度的抑制能力，這一結(jié)論與抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。抑菌活性順序?yàn)椋荷抽T氏菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。

圖3 MMT(a)和ZnO/MMT(b，c和d)的抑菌圈試驗(yàn)Fig.3 Inhibition zone test of MMT (a) and ZnO/MMT (b, c and d)

Salmonella/mg·mL-1MICMBCE.coli/mg·mL-1MICMBCS.aureus/mg·mL-1MICMBC1.603.206.402.803.202.80

4 結(jié) 論

以蒙脫石為載體，采用離子交換法和共沉淀法制備了ZnO/MMT抗菌材料。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選出ZnO/MMT最優(yōu)制備條件，即氯化鋅與氫氧化鈉比為1∶8，反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為18 h。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，ZnO/MMT抗菌材料對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較好的廣譜抗菌活性。