小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

張艷霞，趙艷艷，郭 營，趙 巖，李斯深，孔凡美

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/土肥資源高效利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

小麥?zhǔn)俏覈谌蠹Z食作物，鉀是小麥必需的營養(yǎng)元素，其直接影響小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)。已有的研究表明，施鉀可以提高小麥產(chǎn)量、改善籽粒品質(zhì)[1-4]，提高其抗旱性[5]，并顯著影響其他營養(yǎng)元素的吸收[6-7]。小麥生產(chǎn)需要大量的鉀，每生產(chǎn)100 kg小麥籽粒需要吸收K2O 5.82 kg[8]，但我國鉀肥資源短缺，鉀肥進(jìn)口依賴度超過50%，鉀肥施用成本很高。實(shí)際上，作為小麥主產(chǎn)區(qū)，我國北方土壤中全鉀含量高達(dá)2.1%，每畝地0—20 cm土層的鉀儲存量高達(dá)1000 kg，但是對植物潛在的有效鉀僅占全鉀量的1%～2%[9]。如何充分利用土壤中的鉀已成為關(guān)注的焦點(diǎn)問題。劉國棟等[10]最先提出，從事植物生理、植物營養(yǎng)、生物化學(xué)、植物遺傳和作物育種等的科學(xué)工作者應(yīng)加強(qiáng)橫向聯(lián)合，對我國豐富的種質(zhì)資源進(jìn)行比較、篩選，探明耐低鉀的機(jī)理和調(diào)控途徑，培育和推廣鉀高效基因型品種，從而緩解我國鉀資源短缺的問題，進(jìn)而降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。而探明小麥鉀效率相關(guān)基因分子標(biāo)記，可通過分子標(biāo)記輔助選擇實(shí)現(xiàn)鉀高效小麥品種的定向改良與培育[11]。本文以黃淮麥區(qū)134份小麥品種 (系) 組成的自然群體為材料，設(shè)置低鉀和正常供鉀兩個(gè)處理，對小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀進(jìn)行鑒定，以該群體檢測到的15230個(gè)差異SNP標(biāo)記為基礎(chǔ)，在群體結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，對鉀效率相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得與小麥鉀效率緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，為小麥鉀效率相關(guān)基因的深度挖掘和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以134份小麥品種 (系) 為供試材料，包括66個(gè)山東品種、24個(gè)河北品種、16個(gè)河南品種、14個(gè)陜西品種、8個(gè)山西品種、2個(gè)江蘇品種、2個(gè)四川品種、1個(gè)澳大利亞品種和1個(gè)加拿大品種(表1)。通過對該群體的9萬個(gè)SNP標(biāo)記差異性檢驗(yàn)，共篩選出有差異的SNP位點(diǎn)15230個(gè)，為鉀效率性狀關(guān)聯(lián)分析提供了分子標(biāo)記數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

試驗(yàn)于2014年12月10日—2015年1月17日(E1) 和2015年3月5日—4月12日 (E2) 在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行。采用營養(yǎng)液培養(yǎng)，正常營養(yǎng)液配方：大量營養(yǎng)元素，KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2(NH4)2SO4·H2O 和 Ca(NO3)2·4H2O，濃度分別為0.2、0.5、1.8、1.5、1.0 mmol/L；微量元素，H3BO3、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O 和 Fe·EDTA，濃度分別為1、0.1、0.5、1.0、1.0 和 100 μmol/L。設(shè)置正常鉀(T1，K 2.0 mmol/L) 和低鉀 (T2，K 0.2 mmol/L) 兩個(gè)處理，2014、2015年兩個(gè)試驗(yàn)處理依次記為T1E1、T2E1、T1E2、T2E2，每個(gè)處理3次重復(fù)。

images/BZ_7_272_286_2179_3169.png

將134份供試小麥品種 (系) 的種子用10%的H2O2消毒5分鐘后萌發(fā)，幼苗長至約7 cm高 (7天)后選擇長勢一致的幼苗 (每個(gè)材料移苗3株) 轉(zhuǎn)移至專用穴盤中，將整個(gè)穴盤置于容積為20升的黑色塑料盒中，營養(yǎng)液每隔3天更換一次，期間用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.2，24小時(shí)通氣。2014年試驗(yàn)期間溫度為5.8～28.6℃，濕度8.6%～85.9%，光照強(qiáng)度0～57.8 klx，移苗并進(jìn)行營養(yǎng)液處理后28天收獲；2015年試驗(yàn)期間溫度為7.5～33.9℃，濕度10.1%～91.3%，光照強(qiáng)度0～69.0，移苗并進(jìn)行營養(yǎng)液處理后28天收獲。

1.3 相關(guān)指標(biāo)測定方法

植株干重：根系和地上部在105℃烘干后，用1/1000天平稱重；

植株樣品鉀含量采用H2SO4-H2O2消解，火焰光度法測定；

鉀積累量為相應(yīng)部位的鉀含量與其生物量的乘積；

鉀利用效率為單位含量的養(yǎng)分支撐的生物量 (鉀利用效率 = 生物量/該部位鉀含量)[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，Powermarker 3.25軟件[13]分析等位變異數(shù)并計(jì)算多態(tài)性信息含量，Structure 2.3.1軟件對供試材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，估測群體結(jié)構(gòu)，并計(jì)算材料相應(yīng)的Q值[14]。估計(jì)最佳群體數(shù)K，其取值范圍為1～15，將MCMC(Markov Chain Monte Carlo) 開始時(shí)的不作數(shù)迭代 (length of burn-in period) 設(shè)為50000 次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100000次，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行5次，依據(jù)似然值最大的原則選取合適的K值作為群體數(shù)目[15]。利用TASSEL 5.0軟件中的GLM模型和MLM模型結(jié)合分子標(biāo)記數(shù)據(jù)、群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和鉀效率相關(guān)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記—性狀的關(guān)聯(lián)分析，確定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀表型變異及關(guān)聯(lián)分析

在兩次重復(fù)試驗(yàn)環(huán)境中，與正常鉀處理相比，低鉀處理?xiàng)l件下供試群體134份小麥品種苗期生物量及鉀效率相關(guān)性狀均表現(xiàn)出顯著差異。低鉀處理下，根、冠及全株鉀含量和鉀積累量均顯著下降，而根生物量及根、冠、全株鉀效率均顯著增加。各供試性狀在兩次試驗(yàn)間均表現(xiàn)出顯著差異。例如，2015年的全株生物量、全株鉀累積量及鉀利用效率均顯著高于2014年，這可能與鉀處理之外的光照、溫度以及濕度的差異有關(guān)。

此外，134份小麥品種生物量及鉀效率相關(guān)性狀也表現(xiàn)出顯著的基因型差異。表2顯示，群體地上部鉀含量變異系數(shù)為6.23%，根系鉀積累量變異系數(shù)為43.57%。群體各性狀均表現(xiàn)出連續(xù)變異，是典型的數(shù)量性狀，遺傳率變幅為5.96%(根系鉀含量)～57.9%(根系干重)。

將兩次試驗(yàn)中的相同處理取平均值然后進(jìn)行性狀間的相關(guān)性分析，結(jié)果表明，除了根系干重與根系鉀含量，植株總鉀含量與生物量性狀，鉀累積量冠比與其它性狀，生物量根冠比與其它性狀及濃度性狀與鉀效率性狀的關(guān)系呈顯著負(fù)相關(guān)或不相關(guān)，苗期小麥鉀養(yǎng)分效率相關(guān)性狀間呈極顯著相關(guān) (表3)。

2.2 小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)

小麥苗期試驗(yàn)共調(diào)查了14個(gè)性狀，分別對兩次試驗(yàn)不同環(huán)境下處理的性狀 (56個(gè)) 以及同一性狀兩種環(huán)境下相同處理的平均值 (28個(gè)) 進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，共獲得顯著關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記1300個(gè)，其中1102個(gè)標(biāo)記被定位在除4D、7D以外的19條染色體上 (表4)。14個(gè)性狀分別定位了27～136個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率7.46%～22.6%。有135個(gè)標(biāo)記在至少兩種處理環(huán)境 (包含平均值) 中被檢測到與同一性狀顯著關(guān)聯(lián) (穩(wěn)定關(guān)聯(lián)標(biāo)記)。其中，在3種環(huán)境下(包括平均值) 均檢測到穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)有三個(gè)：Excalibur_c14273_1407、BS00094893_51和 Ku_c11150_773，分別與生物量根冠比、地上部鉀利用效率和根系鉀利用效率顯著關(guān)聯(lián)。其中與根系鉀利用效率穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的Ku_c11150_773貢獻(xiàn)率達(dá)到15.7% (表5)。

2.3 苗期生物量及鉀效率相關(guān)性狀簇集位點(diǎn)

試驗(yàn)篩選出同時(shí)與至少6個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記4個(gè)，分別為Excalibur_c8670_972、Excalibur_c115824_267、wsnp_Ku_c13311_21255428、IACX-5989，分別定位于6D、3B、3B、4B染色體上，貢獻(xiàn)率8.43%～12.57% (表6)。

3 討論

3.1 低鉀對小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀的影響

大量研究表明，鉀脅迫會限制植物生長，降低生物量[16-18]。本研究在兩次低鉀脅迫環(huán)境下，小麥苗期地上部干重、植株總干重顯著下降，根系干重下降不明顯，生物量根冠比在低鉀脅迫環(huán)境下顯著增加，這些研究結(jié)果與梁雪等[19]和Kong等[20]的研究結(jié)果一致。這表明為了適應(yīng)低鉀脅迫環(huán)境，增加對鉀養(yǎng)分的吸收和利用，小麥會增加碳水化合物在根系中的分配，從而使根冠比增加。低鉀處理下苗期小麥植株鉀的累積量均顯著下降，但鉀利用效率均顯著增加。

表 2 供試小麥群體苗期鉀效率相關(guān)性狀的表型變異Table 2 Phenotypic variation of K efficiency related traits of wheat at seedling stage for tested materials

續(xù)表 2 Table 2 continued

表 3 苗期小麥鉀效率相關(guān)性狀間的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficients among K efficiency related traits of wheat at seedling stage

表 4 小麥苗期性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)數(shù)量及其對表型變異的解釋率Table 4 Loci associated seedling traits and the phenotypic variations explained by them

3.2 與鉀效率相關(guān)的性狀間的相互關(guān)系

鉀效率是一個(gè)非常復(fù)雜的性狀，對鉀高效基因型的性狀表現(xiàn)已有大量研究，但到目前為止，鉀效率仍然沒有公認(rèn)的評價(jià)指標(biāo)。一般認(rèn)為，植物鉀素效率包含相互關(guān)聯(lián)的兩個(gè)方面，一是植物從土壤里吸收鉀素的效率 (吸收效率)；二是植物利用吸收的鉀素獲得產(chǎn)量的效率 (利用效率)。從植物角度講，吸收效率也就是在相同鉀供應(yīng)強(qiáng)度下植物吸收累積鉀的能力，吸收累積量大的鉀吸收效率高，而利用效率是植物體內(nèi)單位養(yǎng)分累積量產(chǎn)生的干物質(zhì)量 (養(yǎng)分含量的倒數(shù))。實(shí)際上，單一養(yǎng)分高效吸收和利用均不一定意味著高干物質(zhì)產(chǎn)量[21-22]。因此，有研究采用生物量與養(yǎng)分利用效率的乘積來評價(jià)養(yǎng)分效率[12]?？梢?，養(yǎng)分效率是一個(gè)十分復(fù)雜的性狀，是植物體內(nèi)眾多基因協(xié)調(diào)作用的綜合結(jié)果。因此，Yang等[23]認(rèn)為鉀效率是植物在中度供鉀和缺鉀的條件下，通過內(nèi)部和外部的一些利用機(jī)制，獲得更高干物質(zhì)產(chǎn)量和 (或) 谷物產(chǎn)量的能力。眾多的養(yǎng)分效率指標(biāo)的計(jì)算和評價(jià)都要用到生物量和養(yǎng)分含量，然后計(jì)算養(yǎng)分累積量、養(yǎng)分利用效率。這些指標(biāo)之間均存在顯著的內(nèi)在聯(lián)系，在遺傳控制上往往表現(xiàn)出復(fù)雜的交叉控制，也就是說不同的性狀可能由相同基因控制，同時(shí)也必然存在不同基因的調(diào)控。因此，做關(guān)聯(lián)分析時(shí)選用所有與鉀養(yǎng)分效率相關(guān)的性狀進(jìn)行分析，也可以在一定程度上反映和探討性狀間的遺傳

控制關(guān)系。

表 5 小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀穩(wěn)定關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)Table 5 The environmental stable markers which associated with seedling K efficiency related traits

表 6 小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀簇集位點(diǎn)Table 6 The marker locations where K efficiency related traits clustered

3.3 小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析及關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

關(guān)聯(lián)分析是目前人們研究植物性狀遺傳學(xué)的重要方法。賴勇等[24]用86個(gè)SSR標(biāo)記與113份大麥材料的農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，郭志軍等[25]用74個(gè)SSR標(biāo)記與172份陸地棉栽培種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；陳甲法[26]用166個(gè)SNP與玉米穗粒腐病抗性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本研究以134份小麥品種 (系) 組成的自然群體為研究材料，利用該群體的15230個(gè)差異SNP標(biāo)記與苗期鉀效率相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，群體多樣性強(qiáng)，遺傳多樣性豐富。此外，本研究利用全基因組SNP標(biāo)記對正常鉀和低鉀處理下小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS分析，采用GLM一般線性回歸和MLM混合線性模型相結(jié)合的方法，并且采用的閾值較高 (P≤ 0.001)，可有效消除由群體分層和親緣關(guān)系引起的偽關(guān)聯(lián)，增加關(guān)聯(lián)結(jié)果的可信度。

盡管目前在小麥上的關(guān)聯(lián)分析研究已有大量報(bào)道，但是針對于小麥養(yǎng)分效率尤其是鉀效率方面的關(guān)聯(lián)分析罕見報(bào)道。利用遺傳群體進(jìn)行QTL分析也可獲得與目標(biāo)性狀遺傳控制有關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn)/基因。小麥鉀養(yǎng)分效率相關(guān)性狀的QTL分析已有部分報(bào)道，也獲得了一些相關(guān)分子標(biāo)記位點(diǎn)。例如，Guo等[27]采用液培法，設(shè)置不同的氮、磷、鉀處理，利用“山農(nóng)483 × 川35050”群體定位到了380個(gè)與小麥苗期氮、磷、鉀效率相關(guān)性狀有關(guān)的QTL；Xu等[28]利用小麥雙單體 (DH) 群體在鉀脅迫的液培條件下定位了65個(gè)小麥苗期鉀、鈉、鎂濃度相關(guān)性狀的QTL；宮曉平[29]利用“魯麥21 × 山農(nóng)0431”群體在鉀脅迫下定位了114個(gè)小麥鉀效率相關(guān)性狀的QTL。這些研究結(jié)果表明，與鉀效率相關(guān)性狀有關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn)環(huán)境穩(wěn)定性均較差，絕大多數(shù)QTL僅在特定環(huán)境中被檢測到，但是也檢測到一些環(huán)境穩(wěn)定性較好的分子標(biāo)記位點(diǎn)。這與本研究的結(jié)果相似。本研究利用小麥自然群體，在不同鉀處理下檢測到了1300個(gè)SNP標(biāo)記與苗期鉀效率相關(guān)性狀(包括生物量) 顯著關(guān)聯(lián)，其中僅有137個(gè)標(biāo)記在至少兩個(gè)環(huán)境 (包括均值) 中與同一性狀穩(wěn)定關(guān)聯(lián)，其中至少3個(gè)環(huán)境下與同一性狀穩(wěn)定關(guān)聯(lián)標(biāo)記有3個(gè)，分別為Excalibur_c14273_1407、Ku_c11150_773、BS00094893_51，分別與生物量根冠比、地上部鉀利用效率和根 系鉀利用效率顯著關(guān)聯(lián)，其中地上部鉀利用效率的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在第一次試驗(yàn) (環(huán)境E1) 中的兩個(gè)鉀處理下均檢測到，而根系鉀利用效率顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記在CK處理兩次試驗(yàn) (環(huán)境E1、E2) 中均檢測到。這些相對穩(wěn)定的位點(diǎn)貢獻(xiàn)率較小，僅為7.46%～22.63%。試驗(yàn)檢測到的所有顯著關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記位點(diǎn)的平均貢獻(xiàn)率為10.87%，這些標(biāo)記位點(diǎn)在本試驗(yàn)設(shè)置的處理/環(huán)境中絕大多數(shù) (84.77%) 僅被檢測到一次，這些結(jié)果表明鉀效率相關(guān)性狀是一個(gè)極為復(fù)雜的數(shù)量性狀，可能由眾多微效基因控制，且受環(huán)境影響顯著。試驗(yàn)檢測到的所有的分子標(biāo)記與前人檢測到的QTL或分子標(biāo)記均不相同。試驗(yàn)環(huán)境處理、供試群體基因組差異都是導(dǎo)致與前人結(jié)果不同的重要原因。

另外，小麥苗期試驗(yàn)還篩選出4個(gè)性狀簇集位點(diǎn)標(biāo)記，分別為Excalibur_c8670_972、Excalibur_c115824_267、wsnp_Ku_c13311_21255428和IACX5989，這些標(biāo)記均與至少6個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)。主要有地上部干重、植株總干重、地上部鉀累積量、植株總鉀累積量、地上部鉀利用效率、植株總鉀利用效率、根系干重、根系鉀累積量相關(guān)性狀，且根據(jù)性狀之間的相關(guān)性可知，這8個(gè)性狀均在P＜0.01的水平上極顯著相關(guān)。其中所有簇集位點(diǎn)均與地上部干重、植株總干重、植株總鉀累積量、植株總鉀利用效率這四個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)。另外，在一些鉀高效和低效品種的表型數(shù)據(jù)中，也驗(yàn)證了這種關(guān)聯(lián)性。例如，鉀低效品種臨抗16號和周99233，在低鉀處理下生物量與鉀效率相關(guān)性狀均顯著降低；而鉀高效品種澳大利亞紅麥和黑小麥76，低鉀處理?xiàng)l件下的生物量與鉀效率相關(guān)性狀均顯著提高。這表明同一位點(diǎn)可能同時(shí)與多個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)。許多養(yǎng)分效率性狀QTL分析結(jié)果也表明，在染色體上存在著熱點(diǎn)QTL區(qū)域[27,29-30]。張國華等[31]研究結(jié)果也顯示了多個(gè)性狀的相互關(guān)聯(lián)現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能是控制這些性狀的QTL相互連鎖或是由于某個(gè)QTL的一因多效引起的。同一標(biāo)記與多個(gè)相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)可用于解釋數(shù)量性狀之間可能存在的遺傳相關(guān)。這些控制小麥鉀效率的高頻表達(dá)位點(diǎn)和性狀簇集位點(diǎn)可能對小麥苗期生長發(fā)育的鉀效率有重要的調(diào)控作用，值得深入探討。

4 結(jié)論

不同鉀處理對小麥苗期鉀效率相關(guān)性狀及其顯著關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記位點(diǎn)均有顯著影響。低鉀處理顯著降低小麥苗期生物量，但生物量根冠比和鉀利用效率顯著增加；絕大多數(shù)與苗期鉀效率相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記僅在一個(gè)鉀處理環(huán)境中出現(xiàn)，環(huán)境穩(wěn)定性較差。有4個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)，包括Excalibur_c8670_972、Excalibur_c115824_267、wsnp_Ku_c13311_21255428和IACX5989，同時(shí)與至少6個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)，是苗期鉀效率相關(guān)性狀遺傳控制的熱點(diǎn)位點(diǎn)，值得深入研究。