便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的研發(fā)和應(yīng)用

韋仲，毛華，黃富榮，方濤

1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 廣州 510282；2.暨南大學(xué) 光電工程系，廣東 廣州 510632

引言

拉曼光譜是一種散射光譜，可以對物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行定性和定量分析，其檢測過程不需要對樣品進(jìn)行特殊預(yù)處理，也不會對樣品造成損傷，具有操作簡便、檢測速度快、精確度高、客觀性強等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)診斷中具有較大的應(yīng)用優(yōu)勢[1-2]。拉曼光譜用于胃癌的診斷研究已經(jīng)有十余年，研究對象包括離體胃癌細(xì)胞[3]、胃癌組織[4]、胃癌動物模型[5]、胃癌患者的血清[6]等，研究手段包括傅里葉變換拉曼光譜[7]、表面增強拉曼光譜[8]和光纖拉曼光譜[9]等。上述研究的結(jié)果均從不同角度證實了拉曼光譜能夠鑒別胃癌，為拉曼光譜技術(shù)向臨床應(yīng)用推廣奠定了基礎(chǔ)。

既往的研究為了獲取精確的光譜數(shù)據(jù)，所使用的拉曼光譜儀均為激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，具有檢測精度高、定位準(zhǔn)確、外界聲噪小的特點，該類設(shè)備體積大、質(zhì)量重，不能隨意移動，價格昂貴，需要定時由專人進(jìn)行日常維護(hù)，需要在暗室環(huán)境下進(jìn)行檢測，在臨床診斷方面的實用性大打折扣。便攜式拉曼光譜儀具有體積小、質(zhì)量輕、便于攜帶、價格低廉等優(yōu)勢，隨著技術(shù)的發(fā)展，便攜式拉曼光譜儀的檢測性能，如分辨率、靈敏度、穩(wěn)定性、抗干擾能力等方面，有了極大的提高，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于制藥在線監(jiān)測[10]、爆炸物監(jiān)測[11]、機(jī)場安檢[12]、食品安全[13]、考古[14]、農(nóng)業(yè)[15-16]、生物醫(yī)學(xué)檢驗[17]等方面的現(xiàn)場檢測。但是便攜式拉曼光譜儀在臨床診斷方面的應(yīng)用研究并不多見，在胃癌的診斷應(yīng)用更少，因此本文介紹了一種便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀，初步探討該設(shè)備對胃癌檢測的可行性，為更進(jìn)一步研制開發(fā)基于內(nèi)窺鏡的光纖拉曼光譜系統(tǒng)提供理論參考。

1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的研發(fā)

1.1 工作原理

由激光器發(fā)出一束激光，經(jīng)輸出光纖傳導(dǎo)，由光學(xué)系統(tǒng)聚焦照射在待測樣品上，產(chǎn)生拉曼效應(yīng)。拉曼檢測儀的探頭對樣品產(chǎn)生的拉曼散射光進(jìn)行收集，經(jīng)由輸入光纖傳輸給拉曼光譜儀，轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號，傳遞至計算機(jī)進(jìn)行信號處理，最終得到拉曼光譜圖像。便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的原理示意圖，見圖1。

圖1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的原理示意圖

1.2 系統(tǒng)組成

1.2.1 激發(fā)光光源

激光具有定向發(fā)光、方向性好、亮度極高、顏色極純、相干性高等優(yōu)點，因此激光是作為激發(fā)光源的最優(yōu)選擇。常用的激光器有的 514.5 nm Ar離子激光器、632.8 nm 的He-Ne激光器、532 nm或者785 nm的半導(dǎo)體激光器。根據(jù)既往的研究[18]可知，在應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)檢測腫瘤組織時，多選用近紅外波段（780～2526 nm）的激光。在這個波段區(qū)間內(nèi)，腫瘤組織的成分中電子從基態(tài)躍遷較少，產(chǎn)生的自體熒光現(xiàn)象較弱，因而熒光干擾也較低，而且相對能量較弱的光子不易使腫瘤組織吸收熱量過多而產(chǎn)熱分解。根據(jù)研究需求，本設(shè)計定制了785 nm半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源。

1.2.2 光纖探頭

便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的光纖探頭的主要功能有兩個，一是輸出激光，使待測樣品產(chǎn)生拉曼效應(yīng)，激發(fā)拉曼光信號；二是輸入光纖，接收樣品所產(chǎn)生的拉曼信號，濾除包括入射激光在內(nèi)的非拉曼信號，并將拉曼信號導(dǎo)出至光譜儀中。

目前拉曼光纖探頭主要有雙光纖探頭和多光纖探頭[19]。雙光纖探頭中的兩根光纖，一根用于激發(fā)樣品，一根用于收集拉曼信號，但是由于光纖本身的背景噪聲較大，不利于提高便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的有效率和準(zhǔn)確率，通過理論分析和蒙特卡羅模擬法（Monte Carlo Simulation，MCS），選用多光纖探頭，建立了適用于便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的深度分辨拉曼光纖探頭。

1.2.2.1 光纖種類的選擇

查閱文獻(xiàn)可知[20]，在785～1200 nm激發(fā)光波長范圍內(nèi)，低羥基濃度的光纖在傳遞拉曼信號過程中，信號衰減更小，同時也可以減少光纖的拉曼散射和熒光效應(yīng)，因而選擇低羥基濃度的光纖。

1.2.2.2 光纖的參數(shù)選擇

光導(dǎo)纖維是一種透明的玻璃纖維絲，直徑只有1～100 μm左右。它是由內(nèi)芯和外套兩層組成，內(nèi)芯的折射率a大于外套的折射率b，光由一端進(jìn)入，在內(nèi)芯和外套的界面上經(jīng)多次全反射，從另一端射出。光纖的主要參數(shù)為數(shù)值孔徑（Numerical Aperture，NA）表征了光纖收集光信號的能力，定義為：

目前公認(rèn)，當(dāng)NA為0.18～0.23時，光纖探頭的采集效率和組織探測深度達(dá)到最理想的水平[21-22]。通過對不同NA值的光纖進(jìn)行傳導(dǎo)效率測定（圖2），便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀選擇NA值為0.22的光纖。

圖2 NA值對傳光效率的影響

1.2.2.3 光纖數(shù)量選擇

以發(fā)射和收集相分離的設(shè)計，內(nèi)部包含多根收集光纖環(huán)繞1根激發(fā)光纖，既能夠減小發(fā)射光纖中產(chǎn)生的背景信號的干擾，又能增大探頭直徑，提高收集效率。通過MCS分析可得，采用六邊形結(jié)構(gòu)的光纖排列能夠使得光纖探頭的設(shè)計更加靈活，信號作用的有效范圍最大化，結(jié)構(gòu)如圖3所示。光纖數(shù)目滿足公式：

圖3 光纖排列結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.2.4 光纖末端角度選擇

最早由Wilson等[23]在1999年提出，將光纖末端切成一定的角度，可以增加拉曼信號的收集效率。Wang等[24]探索研制在體內(nèi)窺鏡的報道中也指出，搭配斜面的光纖可以明顯接收拉曼信號的效率，利用MCS發(fā)現(xiàn)當(dāng)NA=0.22時，搭配斜面光纖的接收效率至少是平面光纖的1.8～4倍。光纖斜面角度（B）對收集效率的模擬，見圖4。

圖4 光纖斜面角度對收集效率的模擬

1.2.2.5 光纖封裝方式

激發(fā)光纖和收集光纖需同時封裝于探頭的一端，需保證既能減少外界聲噪的干擾，又可以盡量減少拉曼信號的丟失。對于激發(fā)光纖，一端采用FC接口封裝，與激光器輸出接口對應(yīng)，另一端采用直徑為4 mm的金屬套筒封裝，并將光纖出口置于套筒端面中心；對于收集光纖，一段采用“外螺紋＋孔”“內(nèi)螺紋＋針”即Small A Type（SMA）接口封裝，具有高力學(xué)強度、高耐久性、高可靠性及低回波損耗等顯著特點，匹配相應(yīng)接口的拉曼光譜儀，另一端采用同樣的封裝。激發(fā)光纖和手機(jī)光纖封裝接口，見圖5。

圖5 激發(fā)光纖FC接口和收集光纖SMA接口

1.2.2.6 物鏡的設(shè)計

為了保證入射激光能夠準(zhǔn)確地照射在待測樣品上，通常會在激發(fā)光纖前加裝光纖準(zhǔn)直器，球面透鏡是最常用的裝置，在物鏡加上一球面透鏡可以起到聚焦光纖的作用，能夠在一定程度上提高探頭的采集效率。物鏡的直徑可根據(jù)球面透鏡的直徑來確定，所設(shè)計的物鏡直徑15 mm，入射光經(jīng)過透鏡后所形成的入射光斑點有效照射直徑為1 mm。物鏡側(cè)面示意圖，見圖6。

圖6 物鏡側(cè)面示意圖

1.2.3 微型光譜儀

微型光譜儀是便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀的核心部件，其性能直接影響到系統(tǒng)的檢測范圍和光譜分辨能力，通常來說，光譜儀的光譜范圍越大，相應(yīng)的光譜分辨力就會越低。目前便攜式拉曼光譜儀所采用的光譜儀光學(xué)結(jié)構(gòu)主要有四種，經(jīng)典的車尼爾-特爾納（C-T）結(jié)構(gòu)，體全息透射光柵結(jié)構(gòu)，全息凹面平場光柵結(jié)構(gòu)，中階梯光柵結(jié)構(gòu)。本設(shè)計選用由荷蘭（北京）愛萬提斯科技有限公司生產(chǎn)的AvaSpec-ULS2048LTEC光譜儀，具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、高采樣速度、低噪聲、大動態(tài)范圍的特點。

利用785 nm半導(dǎo)體激光器、傳導(dǎo)光纖、光纖探頭、微型光譜儀、載物臺及安裝光譜分析軟件的計算機(jī)構(gòu)建便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀，系統(tǒng)全貌如圖7所示，主要參數(shù)如表1所示。

圖7 便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀

表1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀主要參數(shù)

2 胃組織標(biāo)本檢測

2.1 實驗設(shè)備

實驗中使用的設(shè)備是便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀和激光共聚焦顯微拉曼光譜儀。激光共聚焦顯微拉曼光譜儀由英國RENISHAW公司生產(chǎn)，基本參數(shù)設(shè)置為激發(fā)光波長785 nm，分辨率 1～2 cm-1，最大激發(fā)光功率約 300 mw，最大波譜范圍 100～3200 cm-1。

2.2 實驗方法

收集行電子胃鏡檢查并經(jīng)病理證實的正常胃粘膜組織和胃癌組織各10例，分別用便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀和激光共聚焦顯微拉曼光譜儀進(jìn)行光譜采集。

2.2.1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀

在普通實驗室環(huán)境下，將待測樣本置于載玻片表面，光纖探頭以支架固定，探測端與待測標(biāo)本緊密接觸，以模擬臨床原位檢測。調(diào)整激光照射至待測樣本，經(jīng)3次掃描累加，完成1次掃描，每個樣品重復(fù)測量3次取平均值，重復(fù)采集以保證實現(xiàn)光譜的可重現(xiàn)性。

2.2.2 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀

在暗室中，將載玻片置于載物臺，用10倍目鏡觀察組織樣品，調(diào)整物鏡方位，使激光焦點聚集到組織樣品上，按預(yù)設(shè)參數(shù)獲得樣品組織的拉曼光譜經(jīng)3次掃描累加，每個樣品重復(fù)測量3次取平均值，重復(fù)采集以保證實現(xiàn)光譜的可重現(xiàn)性。

2.3 實驗結(jié)果

原始光譜信號包括自體熒光信號、噪音和拉曼信號，利用Raman-Wire3.2軟件和一種基于R語言的背景去噪程序，只留下組織的拉曼光譜信號。使用Matlab及Origin Pro8軟件在計算機(jī)上對所得光譜圖進(jìn)行處理比較。圖8和圖9顯示為兩種設(shè)備獲取的正常胃粘膜組織和胃癌組織平均拉曼光譜，從圖中可以看到，胃粘膜組織的主要拉曼光譜 波 峰 位 于 829、853、964、1003、1032、1154、1316、1450、1659 cm-1。其歸屬主要來源于蛋白質(zhì)和脂類，與已知的結(jié)果是一致的。便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀所獲取的光譜結(jié)果雖然在強度上略有差異，但其所表現(xiàn)的光譜具有較好的完整性。

圖8 正常組織的拉曼光譜

圖9 胃癌組織的拉曼光譜

3 討論及總結(jié)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國有較高的發(fā)病率和死亡率，及早診斷對胃癌預(yù)后意義重大[25]。大量的基礎(chǔ)研究已經(jīng)證明，拉曼光譜技術(shù)可以實現(xiàn)無損、快速、客觀地鑒別出胃癌組織和正常組織，將這一技術(shù)與臨床結(jié)合，為胃癌的診斷提供了新的技術(shù)和思路。本文闡述了一種便攜式光纖拉曼胃癌檢測儀，785 nm半導(dǎo)體激光器能合理激發(fā)樣本組織產(chǎn)生拉曼效應(yīng)，獨立設(shè)計研制的光纖探頭能夠?qū)崿F(xiàn)良好的傳導(dǎo)和收光，微型光譜儀能夠?qū)崿F(xiàn)實時光電轉(zhuǎn)換，輸出可視化光譜。利用該系統(tǒng)在普通環(huán)境中對正常胃粘膜組織和胃癌組織進(jìn)行檢測，獲得的光譜與共聚焦顯微拉曼光譜儀所測同類樣品的光譜具有較高的一致性，說明該系統(tǒng)具有較好的檢測能力，更重要的是便攜系統(tǒng)本身具有體積小、質(zhì)量輕、便于攜帶及維護(hù)、價格低廉等優(yōu)勢，為實現(xiàn)臨床應(yīng)用提供了可能。下一步，將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究，繼續(xù)將設(shè)備微型化，設(shè)計研發(fā)一種可以通過胃鏡檢測孔的檢測設(shè)備，實現(xiàn)在常規(guī)胃鏡檢查的同時，對胃黏膜進(jìn)行拉曼檢測以鑒別正常組織和癌變組織，為臨床診斷提供依據(jù)。