基于ITS序列對(duì)市售常見食用菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究

宋立志

(遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州115213)

食用菌俗稱“蘑菇”，是一類可供人類食用的大型真菌，鮮食美味可口，干菇有濃郁的香味，風(fēng)味獨(dú)特，有“素中之葷”的美名。食用菌富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素并兼具食療價(jià)值。我國(guó)目前進(jìn)行商業(yè)性栽培的食用菌種類大約有四五十種，但在產(chǎn)品名稱上，經(jīng)常發(fā)生商業(yè)名稱、學(xué)名和俗名相互混淆和張冠李戴現(xiàn)象，甚至同物異名、同名異物[1]。做好食用菌菌種鑒定及種質(zhì)資源保存，是保證食用菌良種在生產(chǎn)中發(fā)揮最佳栽培效果的主要措施之一，是相關(guān)研究人員應(yīng)該尤為重視的工作。

食用菌的菌種鑒定目前采用的基本上是傳統(tǒng)形態(tài)特征結(jié)合ITS(Internal transcribed spacer)序列分析來(lái)完成。 ITS是核糖體rDNA中介于18S與5.8S之間、5.8S與28S之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，其保守性表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間高度特異[2]。本研究通過 ITS序列分析方法對(duì)市售5種食用菌子進(jìn)行分子鑒定，初步確定分類學(xué)地位，為食用菌種質(zhì)資源提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試真姬菇、杏鮑菇、蟹味菇、香菇和平菇購(gòu)自遼寧省蓋州市聚富市場(chǎng)，各食用菌形態(tài)見圖1，分別標(biāo)記為ZJG、XBG、XW、XG、PG。

圖1五種常見食用菌子實(shí)體形態(tài)

從左至右依次為ZJG、XBG、XW、XG、PG

1.2 培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水1000mL，pH自然。稱取馬鈴薯200g并切成1cm見方的小塊，放入水中煮沸20～30min，用八層紗布進(jìn)行過濾，過濾后加入葡萄糖、瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000mL，分裝錐形瓶，121℃，0.15MPa高壓滅菌20min，備用。

1.3 酶及生化試劑

TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；TaqDNA Polymerase購(gòu)自Thermo公司；引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列為：ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種分離。子實(shí)體用75%酒精輕輕擦拭2～3遍，在超凈工作臺(tái)中，將子實(shí)體沿菌蓋中央輕輕掰開，用解剖刀在子實(shí)體菌柄與菌蓋交界處取黃豆粒大的菌肉接種至PDA平板培養(yǎng)基中，每個(gè)平皿接種1塊菌肉，用封口膜封口后置于25℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌落直徑達(dá)到1cm后，挑取邊緣新鮮菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接2～3次，培養(yǎng)好的菌種置于4℃冰箱中存放。

1.4.2 菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測(cè)。菌絲25℃下靜置培養(yǎng)7d后，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，使用TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，具體操作方法按說明書進(jìn)行，提取的DNA溶于TE中，并置于-20℃保存?zhèn)溆?。?μL提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用Syngene G:BOX凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.4.3 ITS-PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)。以基因組DNA為模板，應(yīng)用真菌通用引物對(duì)ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS-PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物(10μmol/L)0.5μL，rTaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL，模板DNA 1μL，用ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止溫度在4℃。反應(yīng)結(jié)束后取6μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)電泳結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登錄GenBank進(jìn)行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)比對(duì)。

1.4.4 系統(tǒng)樹構(gòu)建。測(cè)序結(jié)果登錄GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，找出與之最大相似性的序列，下載相似性序列的ITS區(qū)域，用Clustalw進(jìn)行多序列比對(duì)，并輔以人工修正，分析時(shí)所有參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。用MEGA 5.0軟件采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建發(fā)育時(shí)進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，重復(fù)抽樣1000次。

2 結(jié)果分析

2.1 菌絲DNA提取及ITS-PCR擴(kuò)增

提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見圖2)，PG、XBGDNA條帶清晰、較明亮，無(wú)明顯后拖尾現(xiàn)象，說明基因組DNA完整，可以作為PCR反應(yīng)的模板。ZJG、XW和XG的DNA雖然有輕微拖尾，但DNA濃度較高，也可以作為PCR反應(yīng)的模板。以提取的DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對(duì)rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示各片段大小約為600～700bp(見圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

M為DL 2000 DNA Marker；CK為水對(duì)照；1,2為PG；3,4為XBG；5為ZJG；6為XW；7為XG

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖

M為DL 2000 DNA Marker；CK為水對(duì)照；1～2為PG；3～5為ZJG；6～7為XB；8～10為XW；11為XG

2.2 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

rDNA ITS區(qū)段序列測(cè)定結(jié)果顯示，各片段長(zhǎng)度在620～751bp，具體比對(duì)結(jié)果如下，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4：

(1)XW序列測(cè)定結(jié)果顯示， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為628bp，測(cè)序結(jié)果登錄GenBank經(jīng)Blast比對(duì)，與XW同源性最高的菌株序列號(hào)分別為：JN234834.1、HM561968.1、JX046031.1、KP765747.1、JX046026.1等，相似性為99%，均為Hypsizygusmarmoreus。

(2)ZJG序列測(cè)定結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為630bp，登錄GenBank經(jīng)Blast比對(duì)，與ZJG同源性最高的菌株序列號(hào)分別為：JX046031.1、JN234834.1、HM561968. 1、MH453612.1、KP765747.1等，相似性為100%，均為Hypsizygusmarmoreus。XW與ZJG比對(duì)之后菌種名相同。系統(tǒng)發(fā)育分析表明XW、ZJG與Hypsizygusmarmoreus(HM561968. 1)等聚為1支，置信度為87%，初步確定XW和ZJG為Hypsizygusmarmoreus。Hypsizygusmarmoreus(Peck) H.E.Bigelow又名Maki Mushroom，為真姬菇也叫姬菇、玉蕈、斑玉蕈，屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、玉蕈屬(Hypsizygus)。真姬菇在日本稱之為“蟹味菇”、“海鮮菇”。外形美觀，質(zhì)地脆嫩，味道鮮鮮，具有海蟹味，目前，栽培品種有淺灰色和純白色2個(gè)品系，白色品系又稱為“白玉蘑”。

(3)PG序列測(cè)定結(jié)果顯示， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為621bp，測(cè)序結(jié)果登錄GenBank經(jīng)Blast比對(duì)，與B6同源性最高的菌株序列號(hào)分別為：LN877896.1、MG840767.1、MG819736.1、MG819161.1、MG282484.1等，相似性為99%，為Pleurotusostreatus。系統(tǒng)發(fā)育分析表明PG與Pleurotusostreatus(登錄號(hào)：LN877896.1)聚為一支，置信度為100%，初步確定PG為Pleurotusostreatus。Pleurotusostreatus中文名為側(cè)耳，又名平菇、北風(fēng)菌、青蘑、桐子菌、糙皮側(cè)耳，屬擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、側(cè)耳科(Pleurotaceae)、側(cè)耳屬(Pleurotus)。

(4)XBG序列測(cè)定結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為620bp，測(cè)序結(jié)果登錄GenBank經(jīng)Blast比對(duì)，與XB同源性最高的菌株序列號(hào)分別為：FJ572244.1、MG819740.1、MG2824890.1、MG282459.1、KY962500.1等，覆蓋度100%，相似性為99%，為Pleurotuseryngii和Pleurotusfuscus。Pleurotusfuscus為杏鮑菇的異名之一[3]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明XBG與Pleurotusfuscus(登錄號(hào)：MG282459.1)等聚為一支，置信度為81%，初步確定XBG為Pleurotusfuscus。Pleurotusfuscus為杏鮑菇又名刺芹側(cè)耳，屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬(Pleurotus)。

(5)XG序列測(cè)定結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為751bp，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI經(jīng)Blast比對(duì)，結(jié)果表明，與XG相似性最高的菌株序列號(hào)分別為：MH141994.1、MH856832.1、AB286067.1、AB286064.1、DQ467888.1菌種名稱均為L(zhǎng)entinulaedodes，Query cover 98%～ 100%，ident均為99.46%～99.73%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明XG與Lentinulaedodes(登錄號(hào)：MH141994.1)聚為1支，置信度為99%，初步確定XG為L(zhǎng)entinulaedodes。Lentinulaedodes為香菇又名冬菇、香蕈、北菇、厚菇、薄菇、花菇、椎茸，是一種食用真菌。屬傘菌亞門、傘菌綱、傘菌目、光茸菌科 (Omphalotaceae)、香菇屬 (Lentinus)。

圖4 五種食用菌系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

3 結(jié)論與討論

眾所周知，食用菌子實(shí)體的發(fā)生和形態(tài)受外界環(huán)境條件影響很大，應(yīng)用子實(shí)體形態(tài)對(duì)菌種進(jìn)行鑒定存在一定的局限性。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)信息資源的不斷豐富，ITS等分子鑒定手段逐漸被人們所關(guān)注。ITS核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列通過與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索比對(duì)，序列相似性≥99%，可以鑒別為相同種；序列相似性為95%～99%，可以鑒別為相同屬[2]。ITS序列分析無(wú)論在無(wú)法人工栽培的菌根菌還是可栽培的常用食用菌鑒定中，應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并在紅菇[4]、鵝膏菌[5]、松乳菇[6]、卷邊樁菇[7]、大肥菇[8]、蒙古口蘑[9]、硫磺菌[10]、深凹漏斗傘[11]等鑒定中成功應(yīng)用。

本文結(jié)合ITS序列分析對(duì)市售常見的食用菌進(jìn)行了分子鑒定，結(jié)果表明真姬菇和蟹味菇為玉蕈屬的Hypsizygusmarmoreus， 平菇為側(cè)耳屬的Pleurotusostreatus，杏鮑菇為側(cè)耳屬的Pleurotusfuscus，香菇為香菇屬的Lentinulaedodes。研究結(jié)果為進(jìn)一步篩選優(yōu)良菌種，提高產(chǎn)量，優(yōu)化母種等研究提供了理論基礎(chǔ)。