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      葉酸促糖尿病腎病大鼠足微循環(huán)改善機制研究

      2019-06-15 10:20:13羅穎羅葉強
      商情 2019年14期
      關(guān)鍵詞:糖尿病腎病葉酸

      羅穎 羅葉強

      【摘要】目的:探討葉酸對糖尿病腎病大鼠足微循環(huán)的改善機制。方法:將25只健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為2組,分別為正常組(5只)和造模組(20只)。給模型組大鼠每天喂高脂高糖日糧,正常組喂基礎(chǔ)日糧。4周后稱量體重,造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液(sTZ,30mg/kg),正常組注射相等容量的檸檬酸鹽緩沖液。喂養(yǎng)2周后,測定正常組與模型組的血糖和胰島素水平。用基礎(chǔ)飼料統(tǒng)一喂養(yǎng)造模后的大鼠和正常組大鼠。模型大鼠隨機分為s證組、和低劑量(1.5mg/kg)、中劑量(3mg/kg)、高劑量(5mg/kg)葉酸組進行干預(yù),再檢測大鼠鼠尾血糖濃度。各組均在干預(yù)灌胃3d后心臟無菌取血制備血清。在底面積75 cm2的培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基進行小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)。將正常組和模型組小鼠足細(xì)胞的培養(yǎng)依次分為空白對照組、stz組、正常鼠血清對照組和添加低、中、高劑量葉酸血清組。刺激24h之后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清VEGF水平,后通過PCR技術(shù)檢測mRNA中VEGF水平,后用蛋白質(zhì)印跡法(wB)檢測蛋白質(zhì)VEGF表達水平。結(jié)果:在高糖組和正常鼠血清組小鼠足細(xì)胞觀察到VEGF的陽性表達。添加葉酸的血清組足細(xì)胞VEGF在蛋白質(zhì)和mRNA中的表達比高糖組和正常鼠血清組有所降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子(VEGF)水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)。

      【關(guān)鍵詞】葉酸 糖尿病腎病 足細(xì)胞 血管生長內(nèi)皮因子

      糖尿病腎?。―N)是目前糖尿病病人最重要的并發(fā)癥之一。在中國,糖尿病腎病的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。其中糖尿病腎病的發(fā)生機制中就有眾多細(xì)胞因子的活化,其中就包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素(Ang)等。研究人員在對糖尿病患者的長期觀察中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的濃度較非糖尿病患者顯著升高。已有研究表明補充葉酸能有效降低糖尿病腎病的發(fā)病率,但補充葉酸對降低糖尿病腎病的發(fā)病率的理論機制并不十分清楚。本研究假設(shè)通過補充葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子(VEGF)水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)。現(xiàn)報告如下:

      一、材料

      (1)動物。健康雄性sD大鼠25只,體重200~220g。

      (2)藥物。葉酸片購于天津力生葉酸片。分別配置低(1.5mg/kg)、中(3mg/kg)、高劑量(5mg/kg)葉酸。

      二、實驗方法

      (一)分組與細(xì)胞培養(yǎng)

      將25只健康雄性sD大鼠基礎(chǔ)喂養(yǎng)1周后隨機分為2組,分別為正常組(5只)和造模組(20只)。模型組大鼠喂每日喂養(yǎng)高脂高糖飼料(基礎(chǔ)飼料加20%的豬油、15%的蔗糖、5%的奶粉),正常組喂以基礎(chǔ)飼料。4周后,稱量體重。造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液(sTz,30mg/kg),正常組注射相同體積的檸檬酸鹽緩沖液。喂養(yǎng)2周后,在正常組和模型組中測量血糖和胰島素水平。模型組大鼠和正常組大鼠繼續(xù)喂食基礎(chǔ)飼料。將成模大鼠隨機分為正常對照組、1%鏈脲佐菌素溶液組(30mg/kg)和低(1.5mg/kg)、中(3mg/kg)、高劑量(5mg/kg)葉酸并注射1%鏈脲佐菌素溶液組(30mg/kg)組進行干預(yù),干預(yù)后檢測大鼠鼠尾血糖濃度。在灌胃3天后心臟無菌取血制備血清。小鼠足細(xì)胞培養(yǎng):將完全培養(yǎng)基加入到底面積為75cm2的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。將正常組和模型組小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)分為空白對照組(Nc)、stz高糖組(HG)、正常鼠血清對照組(NR)、和加入低劑量(LJ)、中劑量(N1))、高劑量(H1))葉酸血清組。

      (二)指標(biāo)檢測

      (1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)計算確定實驗所需的板條數(shù)量,并將其取出后再放置于框架中。設(shè)置空白孔并僅添加TMB顯色液和終止液在空白孔中。對每次實驗進行標(biāo)準(zhǔn)測試,并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)孔中,并在室溫下溫育120分鐘。將板洗滌5次并加入生物素化的抗體工作溶液。在室溫下孵育60分鐘。將板洗滌5次,加入酶結(jié)合物工作溶液,在室溫下進行避光孵育20分鐘。將板洗滌5次,再加入顯色劑TMB100ul/孔,黑暗中溫室孵育20分鐘,加入50u1/孔的終止液,混合均勻后立刻測量0D450的值。

      (2)熒光實時定量PCR技術(shù)用于檢測mRNA中VEGF水平。

      (3)免疫印跡法蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)分析蛋白質(zhì)中VEGF的表達水平

      (三)統(tǒng)計學(xué)方法

      使用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。測量數(shù)據(jù)中計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,統(tǒng)計方法使用單因素方差分析和LSD檢驗。

      三、結(jié)果

      (一)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測大鼠血清VEGF水平

      正常組和高糖組的細(xì)胞漿與核周均可見VEGF陽性表達且表達量接近。然而,添加了低、中、高劑量的葉酸組中VEGF的表達較低。

      (二)熒光實時定量PCR檢測mRNA中VEGF水平

      添加葉酸組mRNA中VEGF表達水平較高糖組和正常鼠血清組明顯降低。(p<0.05)葉酸劑量與VEGF表達水平呈負(fù)相關(guān)。

      (三)蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測蛋白質(zhì)VEGF表達水平

      由表1結(jié)果可知與正常大鼠血清組相比高糖組中VEGF的表達情況明顯升高。添加不同劑量葉酸后各組大鼠VEGFmRNA表達量均有所降低。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(P<0.05)

      四、討論

      VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)是促進血管新生的促血管生成因子。研究表明慢性高血糖癥能刺激VEGF合成和分泌,并引發(fā)一系列代謝和血液動力學(xué)效應(yīng),導(dǎo)致VEGF增加,并導(dǎo)致DM微血管并發(fā)癥。葉酸是一種水溶性維生素,在基因調(diào)控所需的甲基化過程中起著甲基供體的作用。Sonny Bherwani等人通過測量糖尿病腎病患者血清葉酸與尿微量白蛋白比值發(fā)現(xiàn)葉酸水平的下降與糖尿病腎病有關(guān)。葉酸的顯著降低使糖尿病腎病的機會增加19.9%。

      本實驗結(jié)果顯示,糖尿病腎病小鼠的足細(xì)胞VEGF表達較對照小鼠高,顯示其在DN微血管病變中的意義重大。我們在飼料中添加不同劑量的葉酸,結(jié)果顯示添加葉酸的血清組小鼠足細(xì)胞VEGF在蛋白質(zhì)和mRNA中的表達均較高糖組和正常鼠血清組降低,由此說明補充葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子(VEGF)水平改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)。為降低糖尿病患者的發(fā)病率和死亡率提供了新的科學(xué)參考依據(jù)。

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