磷酸三(1，3-二氯二丙基)酯(TDCPP對斑馬魚胚胎急性毒性研究)

王瑋彤，趙雪松

(吉林師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 四平 136000)

0 引言

阻燃劑被廣泛應(yīng)用在電子、電器、化工、交通、建材、紡織品、石油、采礦等領(lǐng)域，成為僅次于增塑劑的材料助劑[1]。以多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated diphenyl ethers， PBDEs)為代表的溴代阻燃劑因其性能優(yōu)越及價格低廉，曾成為最重要的有機(jī)阻燃劑[2]，但由于其在環(huán)境中具有持久性、生物富集性和生態(tài)毒性，歐盟、美國、加拿大和中國等相繼發(fā)布系列政策限制或禁止PBDEs的使用。而有機(jī)磷阻燃劑(Organophosphorus flame retardants， OPFRs)因能滿足新型阻燃劑高效、低煙、低毒、多功能的要求，產(chǎn)量和使用量逐年增加，現(xiàn)成為當(dāng)今阻燃劑研究的熱點(diǎn)[3]。磷酸三(1，3-二氯二丙基)酯(TDCPP)是一種典型的有機(jī)磷阻燃劑，廣泛應(yīng)用于建材、紡織、化工以及電子等行業(yè)[4]。由于TDCPP屬于添加劑，以非化學(xué)鍵方式添加到產(chǎn)品中，導(dǎo)致其易于擴(kuò)散到周圍環(huán)境中[5]，因此它雖作為溴代阻燃劑的替代品，但是也屬于環(huán)境中廣泛存在的新興持久性有機(jī)污染物。環(huán)境監(jiān)測的數(shù)據(jù)顯示，目前全球室內(nèi)和室外空氣、地表和地下水、沉積物和生物群TDCPP的檢測率極高。例如：美國加利福尼亞地區(qū)室內(nèi)灰塵中TDCPP的濃度為2 100 g/g[6]；Green等研究發(fā)現(xiàn)挪威垃圾填埋場與機(jī)動車銷毀處沉積物中OPFRs濃度較高，分別為746 000～1 790 000 g/kg與27 700～33 800 g/kg，其中TDCPP的濃度分別為250～8 800 g/kg與1 500～4 100 g/kg[7]；Chen等研究發(fā)現(xiàn)，挪威沿海地區(qū)黑背鷗和銀鷗的鳥蛋中TDCPP濃度分別達(dá)到1.9 ng/g與0.17 ng/g[8]；我國廈門與青島附近海域TDCPP的濃度范圍為24.1～377 ng/L[9]；珠江中草魚(Clariusfuscus)與鯰魚(Cyprinusidellus)體內(nèi)TDCPP的濃度均達(dá)到了251 ng/g(濕重)[10]。

斑馬魚(zebrafish， danio rerio)，又名藍(lán)條魚，體長約4～5 cm，體呈紡錘形，其體側(cè)斑紋酷似斑馬。近年來，斑馬魚作為一種非常好的實驗?zāi)Ｐ?，被越來越多的?yīng)用到毒性測試和獨(dú)立研究中。美國環(huán)境保護(hù)署(USEPA ECOTOX Database，2000)和經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織(OECD，1998)曾將斑馬魚列為研究內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)對脊椎動物影響的模式生物之一。本實驗以斑馬魚胚胎作為受試生物，觀察TDCPP暴露對水生生物急性發(fā)育毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

TDCPP，純度>99.9%，購自Sigma公司。二甲基亞楓(DMSO)購自Sigma公司。儲備液配置方法：取1 g/L TDCPP 1 mL和DMSO 9 mL混合均勻，即把1 g/L TDCPP溶液稀釋為100 mg/L TDCPP儲備液。稀釋液為經(jīng)過珊瑚砂、陶粒、活性炭和濾棉過濾滅菌超過24 h的自來水。用移液槍分別取50 μL，200 μL，800 μL和1.8 mL TDCPP儲備液，各自用稀釋液定容到1 L，即為濃度分別為5 μg/L， 20 μg/L， 80 μg/L和180 μg/L的暴露液。

1.2 斑馬魚的養(yǎng)殖與胚胎的收集

實驗所用的斑馬魚購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，健康狀況良好。將斑馬魚雄雌分開放置在實驗條件相同的魚缸中，魚缸所用水來自經(jīng)過充分曝氣且滅菌后的循環(huán)水箱。水溫恒溫28 ℃，pH值6.5～7，每日投喂三次新鮮的豐年蟲卵。豐年蟲卵孵化方法如下：取蟲卵3 g和食用鹽20 g加入到1 L水中，曝氣孵化28 h，水溫恒溫28 ℃。親代斑馬魚養(yǎng)殖30天后，可用于孵化胚胎。按照雌魚與雄魚1∶2選取健康活潑的成年斑馬魚進(jìn)行交配。在魚缸內(nèi)鋪放兩層網(wǎng)，防止親魚誤食魚卵。前一天晚上將雌雄斑馬魚共同放置在黑暗環(huán)境下12 h，第二天光照追逐，光照1 h后在顯微鏡下挑選囊胚期的胚胎用于暴露實驗。

1.3 暴露實驗

實驗共設(shè)置濃度為0， 5 μg/L， 20 μg/L，80 μg/L和180 μg/L的TDCPP暴露組，在5個直徑為180 mm的結(jié)晶皿中分別放入200 mL不同濃度的暴露液以及600個健康的斑馬魚胚胎，暴露斑馬魚胚胎至受精后168 h(168 haf)。每隔一天更換染毒溶液，并挑選出雜物和死亡胚胎。

1.4 急性發(fā)育指標(biāo)統(tǒng)計方法

在暴露期間，觀察胚胎的形態(tài)發(fā)育，記錄并統(tǒng)計胚胎24 haf，48 haf，72 haf，96 haf以及120 haf的存活率、48 haf和84 haf的心率、72 haf的孵化率和畸形率，以及168 haf的體長、體重，并繪制成柱形圖進(jìn)行比較分析。具體統(tǒng)計方法參照文獻(xiàn)[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎存活率的影響

圖1為急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎存活率的影響。

圖1 急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎存活率的影響

由圖1可知，與對照組相比，TDCPP的急性暴露引起了斑馬魚胚胎存活率的降低，高濃度暴露組尤為明顯。在濃度為5 μg/L，20 μg/L與80 μg/L的TDCPP暴露液中，24～120 haf胚胎/幼魚存活率分別從94%降低至80%，91%降低至78.4%，88%降低至78%，但是與對照組120 haf時的96%相比差異不太顯著。在高濃度暴露組180 μg/L TDCPP中，24～120 haf胚胎/幼魚存活率由73%顯著降低至45%，并且在72～96 hpf，存活率降低幅度較大，說明幼魚孵化出膜后，失去了絨毛膜的保護(hù)作用，直接暴露于高濃度的TDCPP導(dǎo)致其大量死亡。本實驗結(jié)果說明TDCPP能夠直接誘發(fā)胚胎死亡，且高濃度的TDCPP對胚胎死亡率的影響更大。Xu等研究也發(fā)現(xiàn)較大濃度的TDCPP會直接誘發(fā)斑馬魚胚胎死亡[12]。

2.2 急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎心率的影響

圖2為48 haf和84 haf急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎心率的影響。

圖2 急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎心率的影響

由圖2可知，與對照組相比，TDCPP暴露組斑馬魚胚胎心率有所降低，但是差異不顯著；而在84 haf，暴露濃度為180 μg/L時，TDCPP對斑馬魚胚胎心率的抑制作用較為明顯，呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系，心率從對照組的116次/min降低到70次/min，下降了39.66%。通過此圖還可以看出，在斑馬魚胚胎/幼魚從48 haf到84 haf的生長發(fā)育過程中，各個實驗組在兩個時間點(diǎn)上的心率差有所減弱，說明胚胎/幼魚適應(yīng)了外源物質(zhì)的刺激。石亞楠等研究也表明心率可以作為研究斑馬魚胚胎毒性的一個重要指標(biāo)[13]。

2.3 急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎孵化率的影響

圖3為72 haf急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎孵化率的影響。

圖3 急性暴露TDCPP對斑馬魚胚胎孵化率的影響

如圖3所示，與對照組相比，72 haf TDCPP暴露組中斑馬魚胚胎的孵化率呈下降趨勢，180 μg/L暴露組顯著下降了19.56%，說明TDCPP能夠抑制胚胎的孵化，并且呈濃度依賴關(guān)系。由此可知在卵裂前，TDCPP就可以通過生物膜滲透進(jìn)去，對胚胎進(jìn)行毒性作用，進(jìn)而抑制胚胎的孵化出膜。高丹等研究表明有機(jī)磷阻燃劑濃度與斑馬魚胚胎的孵化率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[14]，與本研究結(jié)果一致。

2.4 急性暴露TDCPP對斑馬魚畸形率的影響

圖4為72 haf急性暴露TDCPP對斑馬魚畸形率的影響。

圖4 急性暴露TDCPP對斑馬魚畸形率的影響

由圖4可知，20 μg/L，80 μg/L，180 μg/L暴露組72 haf幼魚畸形率較對照組顯著增加，分別由對照組的6.98%增加至15.23%，30.64%與37.3%。在5 μg/L暴露組中雖然幼魚也出現(xiàn)了形態(tài)學(xué)的異常，但是與對照組沒有顯著差異。高濃度暴露組致畸的主要原因可能是因TDCPP的濃度超過了胚胎所能承受的范圍，導(dǎo)致胚胎細(xì)胞凋亡，或者發(fā)生DNA損傷，影響與發(fā)育直接相關(guān)的功能基因和蛋白表達(dá)，最終誘發(fā)幼魚畸形。圖5為在急性暴露期間TDCPP導(dǎo)致的幼魚形態(tài)學(xué)異常，包括尾部畸形、卵黃囊水腫和心包水腫。本研究結(jié)果說明TDCPP對斑馬魚胚胎具有明顯的致畸效應(yīng)。

(a)發(fā)育正常 (b)尾部畸形

(c)卵黃囊水腫 (d)心包水腫 圖5 斑馬魚發(fā)育形態(tài)

2.5 急性暴露TDCPP對斑馬魚幼魚體重、體長的影響

圖6為168 haf急性暴露TDCPP對斑馬魚幼魚體重、體長的影響。

圖6 急性暴露TDCPP對斑馬魚幼魚體重、體長的影響

由圖6可知，在暴露實驗進(jìn)行7天后，幼魚的體重沒有顯著的變化(圖6a)，高濃度暴露組幼魚體重僅從對照組的11.165 mg減少到10.632 mg，差異不顯著，但是體長則受到顯著抑制(圖6b)，高濃度暴露組幼魚的體長由對照組的2 624.35 μm顯著降低至2 170.18 μm，表明急性暴露TDCPP能夠顯著抑制幼魚的生長發(fā)育。

3 結(jié)論

實驗證明，急性暴露TDCPP能夠影響斑馬魚胚胎/幼魚的發(fā)育，表現(xiàn)為存活率降低、畸形率增加、孵化率降低以及心率和體長受到顯著的抑制，并且這種影響隨著暴露液TDCPP濃度的增大而明顯。