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    納米TiO2對(duì)菲律賓蛤仔消化腺中Cd的蓄積與生化響應(yīng)的影響?

    2019-06-15 02:07:48潘進(jìn)芬張雪嬌張婷婉王竹梅
    關(guān)鍵詞:雙殼蛤仔毒性

    張 博, 潘進(jìn)芬??, 張雪嬌, 張婷婉, 王竹梅

    (1. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266100; 2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266100)

    納米二氧化鈦(n-TiO2)是在個(gè)人消費(fèi)品(防曬霜、牙膏等)和工業(yè)生產(chǎn)(顏料、紙、油墨添加劑、塑料等)中應(yīng)用最廣泛的一種納米材料。在n-TiO2大量使用過(guò)程中,其不可避免地被釋放到城市和工業(yè)廢水中,并最終進(jìn)入河流、湖泊、海洋等水環(huán)境中。Mueller 和 Nowack[1]利用n-TiO2全球生產(chǎn)量、n-TiO2在各類產(chǎn)品中的分配比例,納米顆粒從產(chǎn)品中的釋放比例及其在各環(huán)境要素中的流量系數(shù)等參數(shù),估算出瑞士地表水中n-TiO2的預(yù)測(cè)環(huán)境濃度(PECs)約為0.7~16 μg·L-1。Tiede等[2]預(yù)測(cè)地表水(飲用水凈化廠進(jìn)水)中n-TiO2的PECs為164 μg·L-1。

    進(jìn)入水相和沉積物中的n-TiO2可能會(huì)與重金屬等相互作用,從而引起重金屬在水生生物體內(nèi)積累量或毒性效應(yīng)的改變[3]。已有學(xué)者研究了n-TiO2與重金屬(尤其是Cd)的聯(lián)合暴露對(duì)淡水和海洋生物的影響[4-6]。n-TiO2能夠降低Cd在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中的積累和毒性效應(yīng)[5];但能夠增強(qiáng)大型溞(Daphniamagna)[4]、斑馬魚(Brachydaniorerio)[7]對(duì)Cd的吸收積累。Balbi等[6]則發(fā)現(xiàn),在聯(lián)合暴露條件下,n-TiO2不會(huì)影響到Cd在地中海貽貝(Mytilusgalloprovincialis)中的生物積累程度,也未增加Cd對(duì)貽貝免疫和消化腺功能及胚胎發(fā)育的不良影響。可見n-TiO2對(duì)Cd生物積累和生物毒性的影響可能存在種間特異性,并且因介質(zhì)種類(如淡水和海水)以及納米材料在介質(zhì)中的性質(zhì)和形態(tài)而變。 因此,需要進(jìn)行更多的研究以確定n-TiO2入海后對(duì)重金屬的生物蓄積性與毒性效應(yīng)的影響。

    生物體在環(huán)境脅迫等逆境條件下能夠產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)(ROS),攻擊細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子,引起生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)(MDA則是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物),而生物體可以通過(guò)改變抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST等)或非酶類抗氧化的水平,以清除ROS,維持細(xì)胞內(nèi)的正常氧化還原環(huán)境。而金屬離子能夠誘導(dǎo)雙殼類動(dòng)物金屬硫蛋白(MT)的合成,從而表現(xiàn)出一定的金屬毒性[6]。

    海洋中的雙殼類動(dòng)物能夠通過(guò)大量過(guò)濾海水而捕獲微粒物質(zhì)和懸浮性污染物,因而常被作為模式生物用于評(píng)估納米顆粒(NPs)對(duì)水生生物影響以及NPs與其他污染物之間的交互作用[6, 8]。菲律賓蛤仔 (Ruditapesphilippinarum)是中國(guó)沿海分布較為廣泛的底棲雙殼類動(dòng)物,從潮間帶到水深10 m左右的水域均有棲息[9]。本研究擬以菲律賓蛤仔為試驗(yàn)物種,將其單獨(dú)和聯(lián)合暴露到n-TiO2和Cd,評(píng)估n-TiO2與Cd單獨(dú)暴露條件下海洋雙殼類對(duì)Cd蓄積性及生物響應(yīng)的影響。需要指出的是,前人多采用高濃度(mg·L-1)[3-4]對(duì)n-TiO2或Cd進(jìn)行水生毒性研究,這些濃度遠(yuǎn)高于目前水環(huán)境中兩種污染物的預(yù)測(cè)濃度或?qū)崪y(cè)濃度。為此,本研究將n-TiO2或Cd的試驗(yàn)濃度設(shè)置為100 μg·L-1,同時(shí)將暴露時(shí)間延長(zhǎng)至2周,以便在接近實(shí)際污染水平的單獨(dú)和聯(lián)合暴露條件下研究Cd在海洋雙殼類中的蓄積量及其亞致死毒性(包括SOD、CAT、GST的活性以及MDA、MT含量)變化。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    納米二氧化鈦(n-TiO2,純度>99.7%,銳鈦礦型,粒徑<25 nm)購(gòu)于Sigma-Aldrich。氯化鎘(CdCl2·2.5H2O,分析純)、硝酸(HNO3,ρ=1.42 g·mL-1,超純)和H2O2(30%,優(yōu)級(jí)純)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    人工海水(ASW):將一定量的海水晶(購(gòu)于濰坊市海佳海水晶廠)溶于超純水配制而成,使用前經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

    硝酸溶液:1體積的硝酸和99體積的水混合得到。

    n-TiO2溶液:將n-TiO2加入到0.45 μm過(guò)濾后的ASW中,冰水浴超聲15 min,得到n-TiO2儲(chǔ)備液(10 mg·L-1),隨后立即稀釋到暴露濃度100 μg·L-1。

    Cd溶液:將1 g CdCl2加至超純水中,配成CdCl2儲(chǔ)備液(10 mg·L-1),隨后立即稀釋到暴露濃度100 μg·L-1。

    菲律賓蛤仔(R.philippinarum)購(gòu)于青島市紅島區(qū)海鮮市場(chǎng),選取反應(yīng)靈敏、大小相近的個(gè)體(殼長(zhǎng)(3.42±0.12) cm,殼寬(2.3±0.14) cm,殼高(1.46±0.09) cm),采用ASW馴養(yǎng)7 d,馴養(yǎng)期間每24 h 更換1次ASW,并持續(xù)曝氣。

    1.2 主要儀器

    T18型高速組織勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司);UV2550型紫外-可見光分光光度計(jì)(日本島津公司);KQ3200B型超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司);MIKRO 200R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司);MARS-Xpress型微波消解儀(美國(guó)CEM公司);RT-6000型酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司);ICAP-6300型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES,美國(guó)Thermo公司)。

    1.3 暴露培養(yǎng)方法

    將經(jīng)過(guò)馴養(yǎng)的菲律賓蛤仔隨機(jī)分組后放入各玻璃缸(30 cm×22 cm×18 cm)中,每個(gè)玻璃缸加入7 L的ASW后放入35只蛤仔。共分為4組進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)(污染物濃度設(shè)置見表1),每24 h換水一次,實(shí)驗(yàn)期間不投喂餌料,且沒(méi)有蛤仔死亡。暴露期間測(cè)定各水質(zhì)參數(shù)為水溫(18.9±0.6) ℃、鹽度(33±0.1)、DO(8.29±0.2) mg·L-1和pH=7.6±0.05。在暴露的0、3、7和14 d,分別從每個(gè)玻璃缸中取5只,立即冰上解剖并分離消化腺,轉(zhuǎn)移到液氮中速凍后于-80 ℃保存待測(cè)。

    表1 不同處理組中n-TiO2與Cd的濃度Table 1 Concentrations of n-TiO2 and Cd in different treatments

    Note:①Cotrol goup;②n-TiO2treatmen group;③Cd treatmen group;④n-TiO2+ Cd treatmen group;⑤n-TiO2concentration;⑥Cd concentration

    1.4 生物化學(xué)分析

    稱取適量解凍后的消化腺組織,按質(zhì)量體積比1∶9加入Tris-HCl(pH=7.4, 0.01 mol·L-1)緩沖溶液[10],用高速組織勻漿機(jī)勻漿后離心(3 000 r·min-1, 4 ℃)15 min得到上清液,用于測(cè)定SOD、CAT、GST、MDA和MT的活性或含量以及蛋白質(zhì)濃度。上述生物化學(xué)指標(biāo)均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

    MRAA+LDA:診斷過(guò)程中,能夠快速?gòu)娜苄蛄星忻姘l(fā)現(xiàn)異常的右位主動(dòng)脈弓;經(jīng)弓降部冠狀切面顯示主動(dòng)脈弓位于氣管右側(cè),順序發(fā)出L-InA、RCCA、RSA,可見DA位于氣管左側(cè);且AO發(fā)出的左側(cè)分支不與降主動(dòng)脈相連。

    SOD測(cè)定:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色,用可見光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí),則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用,使測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值,由此可計(jì)算被測(cè)樣品中的SOD活力(U·mg prot-1)。

    CAT測(cè)定:CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速中止,剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物,根據(jù)其在405 nm處的吸光度變化可計(jì)算得到CAT活力(U·mg prot-1)。

    GST測(cè)定:GST具有催化還原型谷胱甘肽(GSH)與1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)結(jié)合的能力,在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi),其活性高低與反應(yīng)前后底物濃度的變化呈線性關(guān)系。根據(jù)GSH濃度的降低幅度可計(jì)算GST活力(U·mg prot-1)。

    MDA測(cè)定:過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合,形成紅色產(chǎn)物,在532 nm處有最大吸收峰,由此可計(jì)算MDA的含量(nmol·mg prot-1)。

    MT測(cè)定:向預(yù)先包被了軟體動(dòng)物MT單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入上清液,溫育;然后加入生物素標(biāo)記的抗MT抗體,再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,再次溫育后,用PBS洗滌,去除未結(jié)合的酶,然后加入底物H2O2和TMB,在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。在450 nm處的吸光度與樣品中MT的濃度呈正相關(guān),由此可計(jì)算MT含量(ng·mL-1)。

    1.5 消化腺中Cd含量測(cè)定

    準(zhǔn)確稱取冷凍干燥后的消化腺樣品(100±0.1) mg,加入9 mL硝酸,待反應(yīng)平穩(wěn)后,再加入3 mL過(guò)氧化氫,然后放入微波消解儀中。消解過(guò)程分兩步:120 ℃,升溫時(shí)間8 min,保持5 min(1 600 W);180 ℃,升溫時(shí)間8 min,保持25 min(1 600 W)。冷卻后,將樣品轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯容器中,置于電熱板上120 ℃趕酸至近干。最后將樣品全量轉(zhuǎn)移到25 mL比色管中,冷卻至室溫后加入硝酸溶液(1體積硝酸∶99體積水)定容混勻。用ICP-AES分析,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算Cd含量(ng·g-1·dw)。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    每個(gè)生化指標(biāo)或Cd含量的測(cè)定結(jié)果均以3次重復(fù)測(cè)定的(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示;采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行處理組和對(duì)照組的差異顯著性檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)顯著性水平為p< 0.05。通過(guò)XLStat2010?進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,OriginLab OriginPro 9.2作圖。

    2 結(jié)果

    2.1 不同處理組中蛤仔消化腺中Cd的含量比較

    (不同字母表示相同暴露時(shí)間下不同處理組之間存在顯著差異(p < 0.05)。 Different letters represent significant differences among treatment groups at the same exposure time (p < 0.05).)

    2.2 n-TiO2和Cd單獨(dú)與聯(lián)合暴露下蛤仔抗氧化酶活性的變化

    由圖2可見,無(wú)論是Cd、n-TiO2單獨(dú)暴露,還是兩者共同存在的情況下,蛤仔消化腺的SOD活性總是與同期的對(duì)照組差異不顯著(p> 0.05)。消化腺的CAT活性僅在Cd暴露3 d后受到顯著誘導(dǎo)(p< 0.05),為對(duì)照組的1.3倍。GST活性的誘導(dǎo)出現(xiàn)在Cd暴露7、14 d后,均為對(duì)照組的1.6倍;而單獨(dú)的n-TiO2處理及其與Cd聯(lián)合暴露均不能引起GST活性的顯著變化(與同期對(duì)照組相比)。

    2.3 n-TiO2和Cd單獨(dú)與聯(lián)合暴露下的蛤仔MDA含量變化

    3個(gè)處理組中消化腺M(fèi)DA含量的顯著變化均出現(xiàn)在暴露中后期(見圖3)。n-TiO2單獨(dú)暴露7 d后,消化腺M(fèi)DA含量顯著上升,但隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng),MDA含量增幅降低,至暴露結(jié)束時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。Cd處理組中,MDA含量的顯著增加出現(xiàn)在暴露結(jié)束時(shí)。當(dāng)2種污染物同時(shí)存在時(shí),MDA含量在暴露7 d后顯著高于對(duì)照組,其后逐漸降低到與對(duì)照組差異不顯著的水平。

    (不同字母表示相同暴露時(shí)間下不同處理組之間存在顯著差異(p < 0.05)。 Different letters represent significant differences among treatment groups at the same exposure time (p < 0.05). )

    2.4 n-TiO2和Cd單獨(dú)與聯(lián)合暴露下的蛤仔MT含量變化

    根據(jù)圖4,3個(gè)處理組中,只有Cd能夠顯著誘導(dǎo)消化腺M(fèi)T的合成,隨暴露時(shí)間延長(zhǎng),這種誘導(dǎo)效應(yīng)持續(xù)增大,暴露3、7、14 d后的MT含量分別達(dá)到同期對(duì)照組的6.5、9.7和50.1倍。同樣濃度的n-TiO2不能誘導(dǎo)MT合成。Cd與n-TiO2共存時(shí)也不會(huì)引起MT含量顯著變化。

    (不同字母表示相同暴露時(shí)間下不同處理組之間存在顯著差異(p < 0.05)。 Different letters represent significant differences among treatment groups at the same exposure time (p < 0.05). )

    (不同字母表示相同暴露時(shí)間下不同處理組之間存在顯著差異(p < 0.05)。 Different letters represent significant differences among treatment groups at the same exposure time (p < 0.05). )

    3 討論

    鎘(Cd)是水生生態(tài)系統(tǒng)中分布廣泛的一種重金屬,美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(USEPA)和歐洲水框架指令(WFD)均將該金屬列為優(yōu)先控制污染物[11-12]。根據(jù)近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道,中國(guó)某些海域表層海水中的Cd已達(dá)到較高污染水平,例如,南中國(guó)海的Cd濃度范圍為47.0~324.2 μg·L-1,平均257.3 μg·L-1[13]。在這種污染形勢(shì)下,作為納米材料的n-TiO2入海后,究竟會(huì)增加還是減輕Cd在海洋生物體內(nèi)的積累與毒害值得關(guān)注。雙殼類動(dòng)物因其分布廣泛、營(yíng)固著生活以及對(duì)重金屬的高富集性、低轉(zhuǎn)化能力和較高耐受性而常被用作海洋環(huán)境污染的指示生物。其中,菲律賓蛤仔(R.philippinarum)是研究重金屬吸收積累及生物學(xué)效應(yīng)的常用物種,通過(guò)急性毒性試驗(yàn)得到的Cd對(duì)菲律賓蛤仔(R.philippinarum)的96 h LC50在2.843 ~ 4.740 mg·L-1之間[14, 15]。

    本研究所設(shè)置的Cd暴露濃度(100 μg·L-1)大約相當(dāng)于上述96 h LC50的1/30~1/50。暴露于該濃度Cd的蛤仔未見死亡,但是消化腺中Cd的積累十分明顯(見圖1),并引起一定的亞致死毒性,表現(xiàn)為GST和MT持續(xù)受到誘導(dǎo)和暴露后期MDA含量的上升(見圖2~4)。GST是II相代謝酶,能夠催化GSH的-SH 與親電子化合物或I相代謝產(chǎn)物結(jié)合,生成低毒或無(wú)毒的水溶性化合物而排出體外[16]。之前的研究已發(fā)現(xiàn)[17],Cd、Zn、Pb、Hg、Cu等重金屬均能誘導(dǎo)櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)消化腺GST的活性。MTs是一類普遍存在于生物體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸(約30%)的蛋白質(zhì),其通過(guò)半胱氨酸的-SH與金屬離子結(jié)合而起到解毒作用。很多研究表明,重金屬可在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)雙殼類MTs合成,根據(jù)MTs含量的變化可反映海洋環(huán)境重金屬污染水平[18-19]??梢?,Cd脅迫下的GST活性上升和MT含量增加是生物體的一種主動(dòng)防御機(jī)制,其作用是控制細(xì)胞內(nèi)溶解態(tài)Cd的數(shù)量,進(jìn)而阻止其對(duì)其它酶(包括抗氧化酶)活性中心的破壞,以保持機(jī)體的抗氧化防御能力。本研究中,暴露于Cd的蛤仔消化腺中SOD、CAT活性并未發(fā)生變化或只有短暫增加(見圖2)支持上述推斷。Ji等[20]的研究同樣發(fā)現(xiàn),經(jīng)亞致死濃度(20和200 μg·L-1)Cd暴露48 h后,菲律賓蛤仔消化腺SOD活性均與對(duì)照組差異不顯著(p>0.05)。SOD、CAT是生物細(xì)胞內(nèi)兩種重要的抗氧化酶(前者的主要作用是清除機(jī)體產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O2·-),生成H2O2;后者則催化 H2O2水解以減輕其對(duì)細(xì)胞的氧化損傷)[21]。SOD活性保持穩(wěn)定,表明在暴露于該濃度Cd的機(jī)體內(nèi)沒(méi)有O2·-的積累。作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物,MDA常作為生物體遭受逆境脅迫的重要指標(biāo)。本研究中,消化腺的MDA含量只在暴露后期出現(xiàn)上升,可能是因?yàn)?,隨著Cd不斷攝入,GST所催化的底物(GSH)因不斷消耗而逐漸減少[22],無(wú)法充分結(jié)合Cd;同時(shí),MT的誘導(dǎo)量已達(dá)到穩(wěn)定水平,無(wú)法螯合更多的Cd,由此造成新攝入的Cd較多以溶解態(tài)存在,抑制抗氧化酶的活性,由此造成ROS積累而引起細(xì)胞的氧化損傷[23- 24]。

    與Cd處理組相比,n-TiO2和Cd的聯(lián)合暴露會(huì)顯著降低蛤仔消化腺中Cd的積累量(見圖1)。由此認(rèn)為,海水中n-TiO2和Cd之間會(huì)產(chǎn)生拮抗作用,進(jìn)而造成蛤仔對(duì)Cd(毒性較低)和Ti(毒性較低)的攝入量降低。與此相應(yīng)的是,本研究觀察到,n-TiO2和Cd的聯(lián)合暴露不能引起蛤仔消化腺的抗氧化酶活性和MT含量的顯著變化,只是造成表征氧化損傷程度的MDA含量在暴露中期的短暫增加(但在暴露結(jié)束時(shí)已回落到對(duì)照水平)。這種變化與n-TiO2單獨(dú)暴露下的生化響應(yīng)非常相似,表明n-TiO2與Cd共存下的蛤仔亞致死毒性減輕主要是由于前者抑制后者的生物積累所致。前人的研究同樣發(fā)現(xiàn),n-TiO2能夠抑制Cd在萊茵衣藻(C.reinhardtii)[5]中的蓄積。這種影響與n-TiO2對(duì)Cd的強(qiáng)吸附能力有很大關(guān)系: pH在4~7 范圍內(nèi),吸附率可達(dá) 97%以上[29];當(dāng)pH>7時(shí),吸附率大于99%[30]。由此推斷,在本研究所用介質(zhì)ASW(pH=7.6±0.05)中,部分Cd被吸附于n-TiO2表面,并隨著后者的凝聚、沉降而轉(zhuǎn)移到介質(zhì)底層,進(jìn)而阻止雙殼類對(duì)Cd的攝入。

    4 結(jié)論

    (1)在Cd濃度100 μg·L-1的ASW中暴露培養(yǎng)14 d,蛤仔消化腺中的Cd積累量持續(xù)增加,但是,同樣濃度的n-TiO2與Cd共存時(shí),暴露結(jié)束時(shí)Cd積累量降低近一半。

    (2)相同濃度條件下,Cd對(duì)蛤仔的亞致死毒性高于n-TiO2,表現(xiàn)為GST和MT的顯著誘導(dǎo)以及暴露后期MDA含量顯著上升;而n-TiO2單獨(dú)暴露只是造成MDA含量在暴露中期顯著增加。

    (3)Cd和n-TiO2聯(lián)合暴露對(duì)蛤仔的亞致死毒性與n-TiO2單獨(dú)暴露的結(jié)果相似,表明n-TiO2能夠通過(guò)抑制Cd的生物積累而減輕后者對(duì)蛤仔的毒性。這種影響與n-TiO2對(duì)Cd的吸附作用有關(guān)。

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