牡蠣諾如病毒多樣性研究中病毒富集方法的評(píng)估

郭 萍， 潘迎捷，2， 喻勇新,2

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院， 上海 201306；2. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306)

諾如病毒(Norovirus，NoV)，又稱為諾瓦克病毒，于1968年在美國(guó)俄亥俄州諾瓦克地區(qū)的一所學(xué)校中暴發(fā)的一起流行性腹瀉的患者糞便中發(fā)現(xiàn)，因此而得名[1-4]。諾如病毒是單股正鏈的RNA病毒，屬于杯狀病毒科，主要分為7個(gè)基因類群，其中GI、GII、GIV型諾如病毒可以感染人類[5-6]，由于GIV型諾如病毒沒有GI和GII型流行，故一般著重于GI和GII型諾如病毒的研究，在GI和GII基因類群中，又可以分別細(xì)分出至少9和21種基因型。

諾如病毒在環(huán)境中傳播的主要載體是以牡蠣為代表的雙殼軟體動(dòng)物[7]。貝類中NoV污染不但危害人體健康，還嚴(yán)重影響我國(guó)的水產(chǎn)貿(mào)易[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣中幾乎含有所有的GI型和大部分GII型諾如病毒[18]，通過對(duì)牡蠣中諾如病毒多樣性的探究，可以更加了解牡蠣中諾如病毒的感染情況，有助于今后對(duì)海產(chǎn)品諾如病毒污染的監(jiān)測(cè)和防控。

目前，對(duì)于牡蠣中RNA提取的方法有很多，但是大部分都關(guān)注諾如病毒檢測(cè)工作，還沒有一個(gè)較好的用于后期宏基因組測(cè)序的提取方法，這需要所提取的RNA盡可能覆蓋整個(gè)生物群體，諾如病毒損失率盡可能低。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)4種常用宏基因組學(xué)研究中病毒富集方法(PEG6000沉淀法、超速離心法、過濾法和直接提取法)[12-15]進(jìn)行評(píng)估，通過加入一定量含有GII.4型諾如病毒基因的慢病毒(Lentivirus)到預(yù)先檢測(cè)為不含諾如病毒的牡蠣消化腺中，經(jīng)過4種方法處理后提取RNA，利用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR對(duì)提取的RNA中Lentivirus進(jìn)行定量，通過計(jì)算回收率來評(píng)估4種方法。同時(shí)為了進(jìn)一步驗(yàn)證4種方法是否有利于去除微生物污染，采用16S rRNA通用引物對(duì)最后提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行驗(yàn)證。目的是為了探尋一種最適用于后續(xù)牡蠣中諾如病毒多樣性研究中RNA提取的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Lentivirus和GII型諾如病毒熒光定量PCR探針引物 帶有GII.4 基因的Lentivirus 合成于深圳市百恩維生物科技有限公司；GII型諾如病毒熒光定量PCR探針(Ring2)引物(COG2F/COG2R)合成于寶生物工程(大連)有限公司,引物探針序列如表1所示。

1.1.2 試劑及儀器 1×PBS磷酸鹽緩沖液、聚乙二醇6000(PEG6000)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購于上海生工生物公司；0.45 μm和0.22 μm濾膜濾器購于密理博中國(guó)有限公司；動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒(貨號(hào)：GK3015)購于上海捷瑞生物工程公司；一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RR055A)，PCRTaq聚合酶購于寶生物工程(大連)有限公司；小型高速冷凍離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、移液槍均采購于德國(guó)艾本德公司(Eppendorf); MP破碎儀購于美國(guó)MP生物公司; 一步法反轉(zhuǎn)錄q-PCR試劑盒(貨號(hào)：4392656)購于美國(guó)ABI生物公司。

1.1.3 采樣 新鮮太平洋牡蠣采集于上海市蘆潮港水產(chǎn)市場(chǎng)(每只約150 g)，處于低溫條件立即帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 按動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄巢氏PCR(Nested RT-PCR) 反轉(zhuǎn)錄巢氏PCR分為反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和巢氏PCR(nested PCR)。RT-PCR具體操作為：1 μL 的逆轉(zhuǎn)錄酶(酶保存在甘油中，吸取和吹打都要緩慢進(jìn)行，以免造成人為誤差)，12.5 μL的2×RT-PCR 緩沖液，0.5 μmol/L的GI和GII型正反向引物(表1)于PCR小管中，加入30 ng的 RNA 模板后，最終以RNase-free ddH2O補(bǔ)足至25 μL。RT-PCR的程序如下：首先50℃下反轉(zhuǎn)錄30 min，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將單鏈 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA(complementary-DNA)，緊接著94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。Nested PCR具體操作為：將第一輪 RT-PCR的產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪PCR的模板。第二輪PCR體具體操作為：將第一輪 RT-PCR的產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪PCR的模板。第二輪PCR體系配方如下：分別取 12.5 μL的2×PCR緩沖液，1 μmol/L的GI和GII型正反向引物(表1)，1 μL的模板于 PCR 小管中，最終用RNase-free ddH2O補(bǔ)足至25 μL。第二輪PCR的程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火保持30 s，72℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)。最后在72℃下保溫15 min加poly-A 尾，以便后續(xù)的 TA 連接和測(cè)序。

1.2.3 牡蠣中諾如病毒檢測(cè) 從水產(chǎn)市場(chǎng)采集完牡蠣后立即在超凈工作臺(tái)中對(duì)其解剖得到整只消化腺，用MP組織破碎儀將消化腺破碎均勻(轉(zhuǎn)速：6 M/S；時(shí)間：30 s)，平均分成幾等分分裝，每份50 mg，保存于-80℃冰箱。取一份牡蠣消化腺按照1.2.1所述的方法提取RNA。利用1.2.2的方法對(duì)所提 RNA進(jìn)行諾如病毒檢測(cè)，通過2%的瓊膠電泳觀察是否產(chǎn)生陽性GI和GII的PCR產(chǎn)物條帶。

1.2.4 一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR對(duì)Lentivirus拷貝數(shù)進(jìn)行定量，20 μL反應(yīng)體系為:10 μL 2×RT mix buffer, 1.8 μL 10 μmol/L的正反向引物(COG2F/COG2R), 0.5 μL 10 μmol/L的探針(Ring 2),0.5 μL的RT-Enzyme，2 μL RNA模板和3.4 μL的ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃預(yù)變性15 min;95℃變性10 min，95℃退火15 s，60℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。在60℃收集熒光信號(hào)。

將108copies/μL GII型諾如病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋, 共稀釋7個(gè)梯度，分別為107～101copies/μL。每個(gè)梯度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作模板加入熒光定量PCR的反應(yīng)體系中來制備絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 PCR引物

注：a為引物5′端在序列M87661的位置；b為引物5′端在序列X86557的位置

1.2.5 病毒富集方法比較 取2 g陰性牡蠣消化腺加入1 μL的Lentivirus,用18 mL的1×PBS將消化腺混勻，在4℃下8000 r/min離心20 min，取上清，并將上清均分為兩部分。方法1(PEG6000沉淀法):取一部分的上清加入PEG6000至2%的終濃度，4℃孵育18 h，緊接著在4℃下8000 r/min離心20 min，棄上清，用100 r/min的Tris-HCl將沉淀重旋，提取RNA；方法2(過濾法)：將另一部分的上清連續(xù)過0.45 μm和0.22 μm后，取濾液提取RNA；方法3(超速離心法)：將方法2中過完膜的濾液9000 g超速離心4 h，棄上清，用100 μL的Tris-HCl將沉淀重旋，提取RNA；方法4(直接提取法)：取2 g陰性牡蠣消化腺加入1 μL的Lentivirus后，直接提取RNA。圖1為本過程的流程圖，對(duì)4種方法提取的病毒RNA進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(如1.2.3所述)來計(jì)算Lentivirus的數(shù)量。

圖1 4種方法流程圖

1.2.6 16S PCR檢測(cè) 以1.2.5提取的RNA為模板，用引物27F/1492R來進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，進(jìn)行16S檢測(cè)，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過2%的瓊膠電泳來觀察條帶的亮弱。

25 μL PCR反應(yīng)體系如下：12.5 μL的2×RT-PCR buffer， 27F(10 mmol/L)和1492R(10 mmol/L)各1 μL，30 ng RNA模板，RNase-free ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

PCR反應(yīng)程序如下：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣中諾如病毒檢測(cè)

在2%的瓊膠電泳觀察是否產(chǎn)生陽性GI和GII的PCR產(chǎn)物(GI:330 bp,GII:343 bp)。如圖2膠圖所示，無諾如病毒GI型或者GII型目的條帶產(chǎn)生，由此選擇該只牡蠣消化腺為實(shí)驗(yàn)樣品，定義為陰性牡蠣。

Nested RT-PCR的瓊脂凝膠電泳圖：M為DNA分子標(biāo)尺(100 bp)；GI為GI型諾如病毒檢測(cè)結(jié)果；GII為GII型諾如病毒檢測(cè)結(jié)果；N為陰性對(duì)照

圖2 牡蠣檢測(cè)結(jié)果

Figure 2 Result of oyster detection

2.2 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR

Lentivirus的起始數(shù)量如圖3-a、b顯示，圖3-a所示標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.996，擴(kuò)增效率為100.057%。圖3-b所示原液和稀釋10倍的Lentivirus都得到一個(gè)良好的擴(kuò)增曲線，即Lentivirus的起始拷貝數(shù)為1.00×105copies/μL。

經(jīng)過4種方法處理后得到的Lentivirus的數(shù)量如圖3-c、d顯示，圖3-c所示標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.999，擴(kuò)增效率為100.889%。圖3-d為4種不同處理后的擴(kuò)增曲線，效果良好。由計(jì)算結(jié)果可知：方法1中Lentivirus的數(shù)量為2.17×103copies/μL；方法2為2.65×103copies/μL；方法3為1.03×103copies/μL；方法4為2.83×103copies/μL。圖3-e、f為第2次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖3-e所示標(biāo)準(zhǔn)曲線為0.997,擴(kuò)增效率為100.125%。由圖3-f的擴(kuò)增曲線計(jì)算結(jié)果可知：方法1中Lentivirus的數(shù)量為2.20×103copies/μL；方法2為2.70×103copies/μL；方法3為1.27×103copies/μL，方法4為2.75×103copies/μL。由這兩次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)可知，計(jì)算結(jié)果相差不大，具有真實(shí)可靠性。

a、b:Lentivirus定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增曲線；c、d：第一次方法評(píng)估結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增曲線；e、f:第二次方法評(píng)估結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增曲線

圖3 熒光定量PCR結(jié)果

Figure 3 Result of RT-q PCR

利用熒光定量PCR的方法對(duì)Lentivirus起始拷貝數(shù)和經(jīng)過4種方法提取后的Lentivirus進(jìn)行定量，通過對(duì)比前后數(shù)量變化計(jì)算出Lentivirus回收率(表2)，由兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)可知這4種方法的Lentivirus回收率無明顯區(qū)別，相比較而言方法1的回收率高于剩余其他3種方法，可初步判斷方法1的效果優(yōu)于另外3種方法。

2.3 16S PCR檢測(cè)

將經(jīng)過4種不同方法提取的RNA用16S RT-PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)，通過2%的瓊膠電泳條帶的亮弱來反映細(xì)菌的污染程度，圖4所示兩次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可看出經(jīng)過這4種方法處理后都存在著一定程度的細(xì)菌污染，而方法4的條帶稍亮于其他方法的條帶，由此可說明方法4存在著相對(duì)較強(qiáng)的細(xì)菌污染。

表2 4種方法回收率的計(jì)算

M:DNA分子標(biāo)尺(200 bp)；1～4：分別代表4種不同方法；N:陰性對(duì)照

圖4 16S PCR檢測(cè)結(jié)果

Figure 4 The result of 16S PCR

3 討論

諾如病毒具有很強(qiáng)的感染能力，感染劑量大約為10到100個(gè)病毒顆粒，具有傳播快的特點(diǎn)。而牡蠣作為諾如病毒環(huán)境傳播的主要載體和濾食性動(dòng)物，具有富集諾如病毒的作用，目前越來越多的人因?yàn)樯郴虬胧斓哪迪牰腥局Z如病毒。傳統(tǒng)的RT-PCR方法并不能反映諾如病毒的流行病學(xué)[12]，通過利用宏基因組學(xué)探究牡蠣中諾如病毒的多樣性，不僅有助于監(jiān)測(cè)海產(chǎn)品污染情況，還可以探尋諾如病毒與環(huán)境中潛在有助于感染的微生物的關(guān)系，更好地了解諾如病毒的傳播[16]。因此探尋一種最適用于牡蠣諾如病毒多樣性研究中RNA提取的方法則顯得至為重要。

在本文中，為了更好地保證牡蠣RNA提取效果，我們針對(duì)目前市面上常有的3款RNA提取試劑盒(捷瑞，GK3015；天根，DP431；凱捷，74904)進(jìn)行了比較，根據(jù)RNA瓊脂糖凝膠電泳圖發(fā)現(xiàn)捷瑞(GK3015)試劑盒提取的牡蠣RNA含量最高，且高濃度的proteinase K可以提高RNA的提取效率，凱捷試劑盒提取牡蠣中RNA的結(jié)果最差，因此將捷瑞試劑盒用于本實(shí)驗(yàn)中提取。此外，由Lentivirus回收率結(jié)果可知方法4>方法2>方法1>方法3, 而根據(jù)核酸凝膠電泳圖條帶亮弱可得細(xì)菌污染程度為方法4>方法2>方法1>方法3?？梢娫谔崛NA時(shí)，對(duì)樣品預(yù)處理過程越多會(huì)導(dǎo)致病毒損失率相應(yīng)增加，但是這個(gè)富集過程在去除細(xì)菌污染方面具有一定的效果。對(duì)于后續(xù)多樣性分析研究中，可能會(huì)由于缺少富集方法而導(dǎo)致它具有較為嚴(yán)重的細(xì)菌污染，對(duì)后期宏基因組測(cè)序產(chǎn)生一定的影響，但是更重要的是直接提取法相對(duì)較高的回收率可以更好地反映牡蠣中諾如病毒的多樣性，尤其是在牡蠣樣品中，諾如病毒顆粒數(shù)目與其他微生物相比只具有很小的比例，減少病毒損失就顯得尤為重要。

通過比較4種目前常用于宏基因組測(cè)序的牡蠣中病毒富集方法，評(píng)價(jià)出一種效果相對(duì)較好的方法運(yùn)用于牡蠣樣品中，可能存在一定的實(shí)驗(yàn)偏差，但為后期順利進(jìn)行牡蠣中諾如病毒的多樣性研究提供科學(xué)依據(jù)。