賽罕烏拉自然保護區(qū)斑羚性激素水平的季節(jié)變化

張 蕊, 陳照娟, 姜秀麗, 王曉玲, 烏力吉, 孟和達來, 陳 琛, 韓瑩瑩, 鮑偉東

(1. 北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院, 北京 100083; 2. 內蒙古賽罕烏拉國家級自然保護區(qū)管理局, 赤峰 025150； 3. 煙臺市福山區(qū)高疃鎮(zhèn)政府, 煙臺 265505)

激素水平的高低一定程度上決定了動物生理狀態(tài)，對于激素水平的檢測往往可以有效地監(jiān)測動物生理狀態(tài)變化，在動物保護尤其是瀕危野生動物的研究與保育中有著重要意義。但針對瀕危野生動物激素水平的研究目前存在很多限制[1-2]，傳統(tǒng)方式例如直接采血等方法，雖能準確獲得野生動物的激素水平數(shù)據(jù)，但存在瀕危野生動物數(shù)量稀少，捕獲難度大，捕獲過程中易對其造成傷害且易引發(fā)應激反應等限制。在此背景下發(fā)展而來的基于非損傷性取樣的方法，雖然在激素水平數(shù)據(jù)的準確程度上不如傳統(tǒng)的直接采血方法，但能夠破除上述各種制約，獲得激素水平的相對變化趨勢，由此逐漸在野生動物激素水平研究中廣泛應用[3-5]。

國內外基于非損傷性采樣法對瀕危野生動物的類固醇性激素開展了大量的研究[6-7]。在對神農架自然保護區(qū)內的川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)種群進行的研究中，從糞便的保存方法及保存時效等角度探討了野生川金絲猴的繁殖生物學特征、應激生理狀態(tài)等[8]。利用放射性免疫分析法(radio immunoassays, RIA)及化學發(fā)光酶免疫分析法(solid-phase chemiluminescent enzyme immunoassay, SPCEI)對墨西哥坎佩切州的黑吼猴(Alouattapigra)種群的糞便性激素進行了調查研究，并比較了兩種方法在測試皮質醇激素(cortisol)、睪酮(testosterone)、雌二醇(estradiol)及孕酮(progesterone)水平上的差異，結果表明兩種方法在皮質醇激素和睪酮檢測分析的有效性方面不存在差異，但放射性免疫分析法在檢測雌二醇和孕酮結果上相對更好[5]。

中華斑羚(Naemorhedusgriseus)為偶蹄目(Artiodactyla)、牛科(Bovidae)、斑羚屬(Naemorhedus)的國家二級重點保護野生動物，被列入國際自然與自然資源保護聯(lián)盟(IUCN)《世界物種紅色名錄》近危級(NT)和瀕危野生動植物物種國際貿易公約(CITES)附錄Ⅰ中[9-10]。斑羚活動范圍比較固定，常在密林深處的懸崖峭壁間活動，生性敏覺機警，一般單獨或成小種群生活[11]。成年斑羚懷孕期為6～8個月，每胎產1～2仔，哺乳期為2個月，1.5～2歲時達到性成熟，壽命為13～18年[12-13]。目前國內外對于斑羚的研究多集中在生境選擇、食性分析、家域分析、分子分析等方面[14-16]，但對其性激素季節(jié)性變化方面的研究還很少。本研究選擇內蒙古賽罕烏拉國家級自然保護區(qū)的斑羚為研究對象，采用放射性免疫分析法(RIA)檢測斑羚糞便樣品中的睪酮、孕酮、雌二醇，關注該地區(qū)斑羚糞樣激素水平的季節(jié)性變化趨勢，并探討造成變化的原因。

1 研究區(qū)域概況

賽罕烏拉國家級自然保護區(qū)位于內蒙古自治區(qū)赤峰市巴林右旗北部山地(118°18′～118°55′E，43°59′～44°27′N)，面積為100 446.1 hm2，其中核心區(qū)總面積為16 340.3 hm2，占保護區(qū)總面積的15.7%；緩沖區(qū)總面積33 750 hm2，占總面積的33.6%；實驗區(qū)總面積為50 355.8 hm2，占總面積的50.7%。氣候屬于半濕潤溫寒氣候，7月份最為炎熱，最高氣溫29℃；1月份最為寒冷，最低氣溫-32℃。年平均降水量400 mm，多集中在6月份至8月份。自然保護區(qū)山高林密，能夠涵養(yǎng)水源，溝谷河流較多，賽罕烏拉屬大興安嶺南部山地的典型地段，北高南低逐漸向丘陵和平原過渡，由森林、灌叢過渡到草原和草甸植被，植物資源非常豐富。豐富的植物資源孕育了豐富的野生動物資源，也為斑羚提供了良好的生境[7]。

2 研究方法

2.1 斑羚糞便樣品采集及處理

本研究采用非損傷性取樣方法，基于前期預調查結果，通過樣點法、樣線法相結合的方式對研究區(qū)域所有適宜斑羚生存的地點進行搜尋采集。同區(qū)域分布的草食性動物除斑羚外，還有狍(Capreoluspygargus)以及東北馬鹿(Cervusxanthopygus)，3種動物的糞便在顆粒大小、糞跡類型等方面差異較大，因此區(qū)分不同物種的糞便難度不大。樣品采集時選取色澤鮮亮的新鮮糞便，采集10～20顆糞粒于一次性自封袋中，記錄每份樣品的采集時間、GPS位點、區(qū)域位置等信息，加入適量無水乙醇固定，存入-20℃條件中備用。本研究采樣時間分別為2015年12月、2016年3月、5月、7月和9月，共采集到斑羚糞便樣品共計554份，同時選用了2013年11月份采集的經(jīng)分子方法鑒定已確定性別的樣品，雌雄性樣品各20份[11](表1)。

表1 斑羚糞便樣品數(shù)量統(tǒng)計

本研究在綜合考慮各種提取方法的優(yōu)劣以后，采用李春等[18]的提取方法，并在實驗過程中加以細微的優(yōu)化，使之能夠有效地適應斑羚的糞便樣品，盡量做到有效便捷。具體步驟如下：

1)取糞便樣品2～3粒于研缽中研碎，去除砂礫及粗纖維，取0.5 g于10 mL離心管中；2)加入4 mL甲醇與水的混合溶液(8∶1)，最大渦旋速度震蕩混勻3 min；3)加入2.5 mL石油醚最大渦旋速度震蕩混勻約1 min；4)室溫條件下3500 r/min離心15 min；5)取甲醇層溶液1.5 mL于2 mL離心管中，至于-80℃條件下保存待測。

2.2 糞便中性激素的檢測

斑羚糞樣中睪酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)的檢測選用北京北方生物技術研究所生產的碘[125I]雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒，產品批號分別為國藥準字S10940093、國藥準字S10940094、國藥準字S19973002，檢測工作由該公司利用XH-6010全自動智能γ免疫計數(shù)器完成,試劑盒檢測后進行聯(lián)機數(shù)據(jù)處理。

1)聯(lián)機處理: 使用log-logit或四參數(shù)數(shù)據(jù)處理模式由電腦自動處理得出結果；2)百分結合率計算：設S0管計數(shù)為B0，各標準管或樣品管計數(shù)為B，非特異管計數(shù)為NSB，則百分結合率計算公式為B/B0(%)=(B-NSB)/(B0-NSB)×100%；3)logit計算：各標準點或樣品管的logit值計算公式為logit=ln[(B/B0)/(1-B/B0)]；4)計算器處理：使用有線性擬合功能的計算器，計算出樣品濃度值；5)對同一時間即同一批次的樣品濃度值計算批內變異系數(shù)CV(Coefficient of variation)，檢測所得數(shù)據(jù)的有效性，批內變異系數(shù)CV(%)=(標準偏差SD/平均值Mean)×100%，<10%即認為所得數(shù)據(jù)為可靠有效數(shù)據(jù)可用作后續(xù)分析[19]。

2.3 數(shù)據(jù)處理

在檢測這一步驟中，每份樣品均檢測了睪酮、孕酮及雌二醇3項指標，之后數(shù)據(jù)處理時采用雄激素(睪酮)與雌激素(孕酮+雌二醇)直接對比初步判定性別的方法，根據(jù)比對結果，將雄激素高的樣品歸為雄性，雌激素高的樣品歸為雌性，以此進行數(shù)據(jù)分析[20]。所得結果使用SPSS17.0分析，GraphPad Prism 7.0作圖。

3 結果與分析

3.1 斑羚糞樣中睪酮(T)的檢測

將所有樣品在數(shù)據(jù)比對之后初步判定性別的情況下，對疑似雄性的所有樣品中的睪酮水平加以整理，由睪酮水平的變化趨勢可知，2016年度睪酮水平峰值出現(xiàn)在7月,為(236.21+23.31)ng/g，水平最低值出現(xiàn)在3月，且3月至7月期間呈現(xiàn)上升趨勢，隨即7月出現(xiàn)下降趨勢。2015年12月至2016年9月各時間段樣品睪酮檢測值批內變異系數(shù)CV分別為：2.40%、5.96%、9.66%、9.87%和8.9%，數(shù)據(jù)的有限性測定均在允許范圍之內。2013年11月雄性個體糞便樣品的檢測結果，睪酮測值介于2016年7月與9月之間，相較于其他月份來看屬于高位水平，且與2015年12月、2016年3月和2016年5月的測值差異顯著(圖1)。

圖1 睪酮水平變化趨勢

**表示與2013年11月樣品相比差異極顯著(P<0.01)；下同

3.2 斑羚糞便中孕酮(P)的檢測

將所有樣品在數(shù)據(jù)比對之后初步判定性別的情況下，對疑似雌性的所有樣品中的孕酮水平加以整理，2016年度孕酮水平峰值出現(xiàn)在5月，為(398.24+39.11)ng/g，顯著高于其他各點(Mann-Whitney檢驗，P<0.05)。水平最低值出現(xiàn)在3月，且3月至5月期間呈現(xiàn)上升趨勢，隨即5月之后出現(xiàn)下降趨勢。2015年12月至2016年9月各時間段樣品孕酮檢測值批內變異系數(shù)CV分別為：9.79%、9.58%、9.82%、9.77%和8.91%，數(shù)據(jù)的有限性測定均在允許范圍之內。2013年11月雌性個體糞便樣品的孕酮測值與2016年12月相當，與其他月份相比處于低位水平。與2016年5月、7月和9月的測值差異顯著(圖2)。

3.3 斑羚糞便中雌二醇(E2)的檢測

由孕酮水平的變化趨勢將所有樣品在數(shù)據(jù)比對之后初步判定性別的情況下，對疑似雌性的所有樣品中的雌二醇水平加以整理，2016年度孕酮水平峰值出現(xiàn)在3月，為(36.36+3.18)ng/g，顯著高于其他各點(Mann-Whitney檢驗，P<0.05)。水平最低值出現(xiàn)在7月，且3月至7月期間呈現(xiàn)下降趨勢。2015年12月至2016年9月各時間段樣品雌二醇檢測值批內變異系數(shù)CV分別為：8.47%、8.75%、9.84%、9.81%及9.89%，數(shù)據(jù)的有限性測定均在允許范圍之內。2013年11月雌性個體糞便樣品的雌二醇測值與2016年12月相差不大，同樣處于低位水平。與2016年3月的測值差異顯著(圖3)。

圖2 孕酮水平變化趨勢

圖3 雌二醇水平變化趨勢

4 討論

4.1 斑羚糞便性激素變化趨勢

動物性腺激素產生和代謝直接影響著生殖系統(tǒng)的功能運轉，與動物繁殖狀態(tài)密切相關。睪酮在雄性動物繁殖行為中起重要作用，而雌二醇及孕酮在雌性動物繁殖活動的啟動和維持中起重要作用，是雌性發(fā)情的基礎。在孕激素及雌激素的共同作用下，雌性動物通過協(xié)同和拮抗兩種調節(jié)途徑調控其生殖生理活動[21-25]。

對于斑羚這一物種的性激素水平研究，目前可供參考的文獻資料寥寥無幾，僅見在泰國清邁對當?shù)厝︷B(yǎng)的8只雄性中華斑羚(Naemorhedusgriseus)的雄激素、腎上腺糖皮質激素水平的季節(jié)性變化研究[26]。該研究發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)條件下斑羚的雄激素雨季(5月16日至10月15日)和冬季(10月16日至翌年2月15日)的水平明顯高于夏季(2月16日至5月15日)，且雄激素代謝水平與溫度與日長成明顯的正相關關系；另外，對于該區(qū)域雌性斑羚的繁殖周期及相應的發(fā)情行為的研究發(fā)現(xiàn)，雌性斑羚的發(fā)情周期季節(jié)性不強，發(fā)情周期約為21 d，妊娠期約為7個月，雌性個體在此期間不動情時間約為2～5個月，并且在交配期間翹尾行為會隨著雌激素的升高而明顯加強[27]。此外，國內對于圈養(yǎng)條件下的斑羚屬物種赤斑羚(Naemorhedusbaileyi)也有少量研究，謝燕對上海動物園繁殖期的赤斑羚的行為節(jié)律變化與對應的性激素水平進行了初步相關性分析，并沒有對赤斑羚整年度性激素水平變化情況進行監(jiān)測[28]。以上研究均受圈養(yǎng)條件限制，雖然在樣品采集及雌雄性和個體判定上具有一定的優(yōu)勢，但是動物的激素水平變化受多方面因素影響，如溫度、光照、食物等，相同的物種在不同的地點或者相同的地點不同的年度往往出現(xiàn)差異。這些研究雖然能夠提供一定的關于斑羚繁殖過程的信息參考，但對于野外自然條件下斑羚的繁殖生理情況具有的參考價值還需要深入探討。

賽罕烏拉自然保護區(qū)志中記載，該地區(qū)斑羚發(fā)情期于每年10月，翌年春季4—5月份左右產仔[17]。本研究中斑羚體內睪酮水平雖然在7月份出現(xiàn)峰值，但是9月份睪酮水平與2013年11月份的睪酮水平差異不顯著，所以9月份睪酮水平處于一個高水平狀態(tài)，一定程度上與上述記載一致。針對7月份出現(xiàn)峰值或許可以從3點原因來解釋：其一，7月份正處于亞成年個體快速發(fā)育的時期，睪酮在雄性個體中主要起到第二性征的形成和維持、精子發(fā)生的起始和維持、雄性性欲的維持等作用，因此雄性個體的睪酮水平在此期間出現(xiàn)較高水平。其二，雄性動物體內的睪酮水平受溫度干擾較大，有些動物在溫度較高的情況下體內睪酮水平會出現(xiàn)峰值，這在靈長類及嚙齒類動物中已有相關結論[29-30]。賽罕烏拉地區(qū)2016年7月份溫度較高，斑羚體內的睪酮水平極有可能隨溫度升高而出現(xiàn)峰值。其三，對普氏原羚(Procapraprzewalskii)糞便中皮質醇激素的保存失效進行了研究，結果表明普氏原羚糞便在-20℃下保存50 d不至引起皮質醇含量的變化，但在野外暴露超過24 h的樣品會造成測定結果產生誤差[31]。7月保護區(qū)夏季，氣溫炎熱，不利于糞便在野外狀態(tài)下的保存，本次研究所采樣品相對都比較新鮮，但是不能完全保證所有的糞便樣品均為24 h內采集的，所以7月份的數(shù)據(jù)可能存在一定的誤差，導致出現(xiàn)峰值。

孕酮在雌性個體中主要起到促進生殖道發(fā)育、調節(jié)發(fā)情、維持妊娠的作用，且低水平的孕酮含量可以促進發(fā)情，但高水平的孕酮含量卻能對抗雌激素的作用，阻止子宮敏感和抑制發(fā)情。孕酮水平的高低一定程度上受食物資源和營養(yǎng)狀況的影響，在我國西北及內蒙古地區(qū)，若遇災年牧草狀況不好時，妊娠母山羊胎盤分泌的孕酮較低，導致流產率偏高[32]。斑羚體內孕酮水平峰值出現(xiàn)在5月，且3月至5月急劇升高而后至7月出現(xiàn)緩慢下降，這可能是食物資源、妊娠狀態(tài)等多種原因綜合影響的結果，這種變化趨勢一定程度上印證了當?shù)匚墨I中所記載斑羚的產仔時間。此外，孕酮除上述維持妊娠等作用外，在哺乳期間也需要較高水平以維持正常的生理功能。

雌二醇在動物體內主要起到誘導發(fā)情行為、維持動物性興奮及促進生殖道發(fā)育的功能。斑羚體內雌二醇水平在3月出現(xiàn)峰值，7月份水平最低，這一點恰好與同時期的孕酮水平形成對比，因為較高水平的孕酮可與雌二醇形成拮抗作用，抑制發(fā)情，此結果也與泰國相關研究中提及的斑羚妊娠期間不動情持續(xù)時間較長的結論類似[27]。

4.2 選取2013年糞便樣品對比研究的必要性

本研究中對于斑羚糞便性激素水平的分析中，選取了2013年11月的樣品對其中的3項激素水平進行了測試，這部分樣品已經(jīng)做過性別鑒定[11]，對其激素水平進行檢測，主要出于以下兩個方面的考慮。

其一，此前并沒有對該地區(qū)斑羚的性激素水平的相關研究，該區(qū)斑羚性激素的變化情況究竟如何需要本研究提供資料參考。但在野外自然條件下，無法對采樣對象的性別進行辨別，本研究亦假設在樣品性別未知的情況下對斑羚性激素水平的整體變化情況進行探索，所以需要一部分已知性別的樣本數(shù)據(jù)進行參考。

其二，通過對2013年樣品中性激素水平的檢測，我們了解到，糞便樣品雖不及血液樣品能夠精準地反應斑羚體內的生理狀況，但是由于采樣便捷、儲存容易的特點給研究工作帶來極大便利，同時斑羚的糞便樣品在保存了近3年之后其中的激素水平依然能夠檢測得到，這給后續(xù)的研究工作提供了新思路，可以嘗試采集對應月份的樣品做一次保存時效的對比分析。

4.3 試驗方法的改進

本研究在進行伊始即假設在忽略樣品性別的條件下對所有采集到的樣品檢測3項性激素水平，直接分析各項指標的月度變化趨勢。后期處理數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，無法通過這種方式獲得良好的結果，容易造成對該區(qū)斑羚繁殖生理狀態(tài)的理解偏差。隨后采用將孕酮及雌二醇兩項測值與睪酮測值對比的方式來初步判定性別，假定雄激素(睪酮)高則表明樣品為雄性，雌激素(孕酮+雌二醇)高則表明樣品為雌性，以此依據(jù)來分析數(shù)據(jù)，得出如上結論，在一定程度上解決了野外自然條件下無法直接判定樣品性別的瓶頸。同時如果想要更加精準的驗證此方法的可行程度，需要利用分子生物學技術來確定樣品性別后再進一步探討。對于利用放射性免疫分析法的超微量分析檢測糞樣性激素濃度各時間段的相對值，可免去提取率低以及樣品中殘留的有機溶劑對試劑盒標記抗原與抗體特異性結合產生影響的擔憂[33]。

綜上所述，通過采集斑羚糞便，利用放射性免疫分析法檢測其中的性激素，進而研究斑羚性激素季節(jié)變化的方法具有可行性強、可靠性高、對動物不構成傷害等優(yōu)點，是一種比較理想的實驗方法，但是在采集的時候也應該嚴格注意糞便的新鮮程度，應保證采集的糞便為24 h內的新鮮糞便，避免后續(xù)的測量結果產生誤差。