植物地下器官花色苷合成及其調(diào)控研究進展

范祺祺 董 文 熊興耀 王萬興 秦玉芝 何長征 胡新喜*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，2011南方糧油協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南省馬鈴薯工程技術研究中心，湖南長沙 410128；2中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

植物花色苷作為一種較優(yōu)良的脂質(zhì)過氧化抑制劑和氧游離基清除劑，具有一定的營養(yǎng)價值和藥理功效。被子植物的花色形成多與花色苷有關，它可引導生物傳粉、抵御紫外線傷害、誘導共生菌的植入，是植物生長過程中不可或缺的次生代謝物質(zhì)。由于其存在的普遍性、天然性，使得花色苷成為制作可食用色素、化妝品著色劑、保健品等商品原材料的首選。

花色苷主要以水溶物的形式存在于植物體細胞液泡中，特異性積累在植物的不同器官上，多積累于植物（如茄子、辣椒）的地上器官花、果實、種子中，具有含量高但總產(chǎn)量小、不易儲存的特點。與地上器官相比，植物地下器官花色苷具有總產(chǎn)量高、抗逆性強、受環(huán)境因素影響較小、具有較好的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性等優(yōu)點。花色苷等植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累受遺傳的控制，不同作物種類和品種的次生代謝產(chǎn)物種類和含量不同，同時次生代謝產(chǎn)物合成也受光照、溫度、水分、養(yǎng)分等環(huán)境因子的影響。探明這些因素對植物次生代謝產(chǎn)物合成和積累的調(diào)控作用機理，對通過遺傳改良和改進栽培措施提高作物的次生代謝物產(chǎn)量具有重要的指導意義，能夠滿足人類對重要次生代謝產(chǎn)物的巨大需求。為加速高花色苷含量的品種選育及其應用，解析花色苷在馬鈴薯、紫甘薯、紫淮山等植物塊莖、塊根中生物合成調(diào)控的分子機制已成為科學家關注的熱點。本文對國內(nèi)外植物花色苷特別是地下器官花色苷的種類、生物合成及調(diào)控機制進行了綜述，并展望了今后的研究重點。

1 植物花色苷及種類

彩色馬鈴薯、紫甘薯、紫淮山等植物塊莖、塊根富含強抗氧化活性物質(zhì)花色苷?；ㄉ赵诮Y構上屬于類黃酮化合物，2-苯基苯并吡喃陽離子衍生物，以C6-C3-C6高度分子共軛體系為基本骨架（圖1），糖苷結合于C3或（和）C5、C7位上，形成花色苷。花色苷類型多種多樣，結構復雜，除了發(fā)生糖苷化的數(shù)目和位點（C3、 C5、C7）差異，結合?；慕Y構、數(shù)量和位置也會導致花色苷種類的多樣化。液泡中的花色苷以互變異構的甲醇假堿、醌式堿、查耳酮假堿以及有色的堿基花色烊正離子4種分子相互平衡的形式存在（任雁和張惟廣，2006），糖苷的類型和位置并不會影響花色苷顏色，但液泡pH值的變化會導致花色苷結構變化從而使花色苷顏色發(fā)生變化?；ㄉ湛寡趸钚匀Q于基本骨架B環(huán)羥基化程度以及?；?、糖基化的類型和程度。被人體吸收后，可以保護機體免受氧化劑、自由基和低密度脂蛋白膽固醇的侵害?；ㄉ兆鳛闆Q定植物花色的物質(zhì)基礎，廣泛存在于27個科73個屬的植物中。目前已知天然存在的花色苷有250多種，在植物中常見的有6種，即天竺葵色素（pelargonidin）、矢車菊色素（cyanidin）、飛燕草色素（delphinidin）、芍藥花色素（peonidin）、矮牽?；ㄉ兀╬etunidin）及錦葵色素（malvidin）（韓海華 等，2011）。這6種常見的花色苷均已在馬鈴薯中被發(fā)現(xiàn)，類型如圖1。紫甘薯中的花色苷主要為?；氖杠嚲丈睾蜕炙幧兀n永斌，2007），含量為 180～832 mg·kg-1（FW）（孫健 等，2013）。紫淮山皮中主要的花色苷為飛燕草色素（傅婧，2011），含量為 167～257 mg·kg-1（FW）（王哲和徐皓，2013）。不同基因型馬鈴薯中花色苷種類和含量不盡相同。Zhang等（2017）研究表明，馬鈴薯花色苷的總含量為21.27～105.63 mg·kg-1（FW）。紅色馬鈴薯表皮中主要包含天竺葵苷（1 180～1 430 mg·kg-1，F(xiàn)W）和少量芍藥苷（75.7～153.4 mg·kg-1，F(xiàn)W）（殷麗琴 等，2015），薯肉花色苷含量為69～350 mg·kg-1（FW）（Brown et al.，2003）；紫色馬鈴薯表皮中主要包含矮牽牛苷（705～2 030 mg·kg-1，F(xiàn)W）和芍藥苷（5.6～569.7 mg·kg-1，F(xiàn)W）（殷麗琴 等，2015），薯肉花色苷含量 為 55～171 mg·kg-1（FW）（Brown et al.，2003；Kita et al.，2015）。

圖1 彩色馬鈴薯中主要的花色苷（Brown et al.，2003）

2 植物花色苷的生物合成

2.1 植物花色苷的生物合成途徑

花色苷是通過植物黃酮類化合物生物合成途徑分支之一的莽草酸途徑合成的，具有高度的保守性，是研究植物基因表達、調(diào)控，闡明基因與環(huán)境互作調(diào)控系統(tǒng)的理想模型（Tanaka et al.，2010）?；ㄉ蘸铣珊痛x的過程在矮牽牛中進行了較為深入的研究（Passeri et al.，2016），基本過程如圖2所示。合成過程需要編碼酶蛋白的結構基因和編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因共同參與，結構基因直接參與花色苷的合成和積累，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)結構基因的表達，并控制色素的時空合成（Sparvoli et al.，1994；Winkel-Shirley，2001）?；ㄉ丈锖铣赏緩娇梢苑譃?個時期。第一時期為多數(shù)次生代謝物質(zhì)共有的苯丙烷途徑。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下脫去氨基，形成苯丙烯酸，之后肉桂酸4-羥化酶使其羥基化形成香豆酸，經(jīng)4-香豆酸輔酶A連接酶的催化作用下形成香豆酸輔酶A。第二時期為類黃酮代謝的關鍵反應。3分子丙二酰-CoA和1分子4-香豆酸- CoA在查爾酮酶的催化下合成4-羥基查爾酮，再經(jīng)查爾酮異構酶的作用下轉(zhuǎn)為柚皮素，柚皮素經(jīng)催化作用形成二氫黃酮醇。第三時期為將無色花色苷變?yōu)楦鞣N顏色的花色苷。在二氫黃酮醇4-還原酶、花青素合成酶和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下形成藍色的錦葵素、磚紅色的花葵素、紫紅色的芍藥色素。紫色馬鈴薯中色素主要來源于矮牽牛素，矮牽牛素可由矢車菊素被甲氧基取代或者由飛燕草素經(jīng)甲基取代形成，類黃酮 3-羥化酶（F3′H）和類黃酮 3，5- 羥化酶（F3′5′H）是矢車菊素和飛燕草素合成的關鍵酶，所以有學者認為F3′H和F3′5′H是促使花色苷多樣化的主要酶（Naito et al.，1998）。二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）的底物特異性也會影響花色苷的組成和色素的形成。

2.2 植物花色苷合成的主要結構基因

圖2 花色苷的生物合成途徑（葛翠蓮 等，2012）

圖3 馬鈴薯花色苷合成途徑

研究表明，花色苷合成過程中編碼酶蛋白的結構基因包括PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等（Jaakola，2013）；在雙子葉植物中，可分為早期（EBG）、晚期（LBG）生物合成結構基因（圖3）。早期生物合成結構基因（CHS、CHI、F3H、F3′H）是參與所有類黃酮生物合成下游常見的類黃酮途徑基因。研究表明EBGs基因在紫色甘薯地上器官中都有表達，且在不同品種甘薯中的表達特性相同，不存在顯著差異（石曉芳，2013）。IbF3H在紫甘薯塊根中表達而白色甘薯塊根中不表達（石曉芳，2013）；在紫、白淮山中的表達量則沒有顯著差異（閆瑞霞 等，2014）；在番茄Aft/Aft突變體（LA1996）中，SlCHS、SlCHI、SlF3H基因的表達與非色素對照基因型無明顯差異（Giovanni et al.，2011）。馬鈴薯塊莖中，EBGs在紅色和紫色的馬鈴薯中都有較高的表達（Jung et al.，2005；Liu et al.，2015，2016），即使在同一塊莖中，有顏色的部分薯肉中StF3H的表達量也比白色薯肉高（Stushnoff et al.，2010）。

晚期生物合成結構基因包括DFR、ANS、UFGT（Borovsky et al.，2004；Stushnoff et al.，2010；Povero et al.，2011）。 紫甘薯中IbDFR、IbANS表達水平較高，且與花色苷含量呈正比（Mano et al.，2007）。LBGs在淮山中沒有一致的表達性，DFR在白淮山中的表達量高于紫淮山，而ANS、UFGT在紫淮山中高度表達，白淮山中基本不表達（閆瑞霞 等，2014）。在許多茄科蔬菜中，LBGs的表達水平與花色苷含量呈顯著正相關。辣椒果實發(fā)育過程中，幼果期的CaDFR、CaANS和CaUFGT表達上調(diào)，即將成熟前達到最大值，在成熟期后出現(xiàn)下調(diào)，這與果實的瞬時花色苷積累模式相對應（Borovsky et al.，2004）。彩色馬鈴薯中StDFR、StANS和StUFGT都有較高表達（André et al.，2009；Jung et al.，2009；Stushnoff et al.，2010；Liu et al.，2015）。

2.3 植物花色苷合成的調(diào)控

2.3.1 調(diào)控花色苷合成的遺傳因素 研究表明，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠上調(diào)EBGs和LBGs的表達，并與LBGs的表達正相關。轉(zhuǎn)基因番茄中2種MYB轉(zhuǎn)錄因子基因SlANT1、SlAN2的超表達促進 EBGs、LBGs和SlAN1（bHLH）相關基因的表達，使花色苷大量積累，其中SlANT1的促進作用比SlAN2更明顯。但SlANT1、SlAN2對bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因SlJAF13、WD40類轉(zhuǎn)錄因子基因SlAN11的表達量無促進作用（Mathews et al.，2003；Schreiber et al.，2012；Kiferle et al.，2015；Meng et al.，2015）。辣椒中發(fā)現(xiàn)CaMYBA可以促進CaDFR和CaANS的表達。馬鈴薯塊莖中的StAN2對DFR和F3′5′H啟動子有明顯的激活作用（Jung et al.，2009）。紫甘薯塊根中特異表達的IbMYB1可與結構基因IbANS啟動子上的MYBCORE和MYBST2元件發(fā)生特異性結合（Dong et al.，2014），并產(chǎn)生IbMYB1a、IbMYB1b兩種不同的轉(zhuǎn)錄本，其中IbMYB1a表達尤為明顯（Chayoung et al.，2010）。將IbMYB1a在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中過表達可導致花色苷合成途徑結構基因表達水平上調(diào)，大量積累花色苷（Kim et al.，2010）。

植物中，主要有AN1、JAF13兩類bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與花青素生物合成的調(diào)控，有觀點認為它們不能相互交換，并參與花青素調(diào)節(jié)的不同步驟（Spelt et al.，2000）。對馬鈴薯的研究中發(fā)現(xiàn)單一StbHLH1的表達不足以調(diào)節(jié)花青素的生物合成，需要StJAF13的激活，才能調(diào)控花色苷的生物合成（Liu et al.，2015，2016，2017）。WD40是另一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，馬鈴薯塊莖中WD40轉(zhuǎn)錄因子，不依賴于AN1、AN2，很可能調(diào)控AN2，在mRNA水平調(diào)控AN2的后轉(zhuǎn)錄，從而控制DFR基因表達（羅遵喜 等，2008）。在白肉馬鈴薯中轉(zhuǎn)入StAN11，可使塊莖顏色明顯加深（劉仕蕓，2007）。Zhang等（2003）研究表明，擬南芥bHLH的調(diào)控作用需要TTG1（WD40）的參與；Suganuma等（2008）認為WD40通過組蛋白修飾參與染色質(zhì)重塑，從而發(fā)揮對轉(zhuǎn)錄的影響過程。

大量研究表明，花色苷生物合成途徑受MYB-bHLH-WD40（MBW）復合物調(diào)控（Ramsay & Glover，2005）。MYB轉(zhuǎn)錄因子主要通過與結構基因啟動子結合決定對MBW復合物的激活或抑制作用，分為MYB激活劑、MYB抑制劑（Koes & Verweij，2005）；bHLH轉(zhuǎn)錄因子決定了識別靶基因啟動子中轉(zhuǎn)錄因子結合位點和激活轉(zhuǎn)錄的特異性（Montefiori et al.，2015）；WD40蛋白為MYB和bHLH蛋白形成MBW復合物提供了一個穩(wěn)定的平臺。AN1可通過MYB-AN1-WD40復合物直接激活花青素生物合成途徑，而JAF13需要通過形成MYB-JAF13-WD40復合物激活AN1活性調(diào)節(jié)該通 路（Montefiori et al.，2015）。R2R3-MYB 激 活劑首先與JAF13、WD40形成MYB-JAF13-WD40復合體，激活AN1，之后AN1代替 JAF13，形成MYB-AN1-WD40復合體調(diào)控相關結構基因的表達（Liu et al.，2015，2016，2017）。此外，植物轉(zhuǎn)錄因子家族中也存在極少的花色苷合成的負調(diào)控因子。矮牽牛中有兩類MYB轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB和R3-MYB抑制子被證明降低了花青素的生物合成。R2R3-MYB在C端含有1個抑制基序，而R3-MYB中不含有此結構。兩種抑制劑都可以與MBW復合物中的bHLH蛋白偶聯(lián)，被動抑制花青素的生物合成。R2R3-MYB可以通過抑制基序主動與目的基因啟動子結合，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄過程，如PhMYB27抑制PhAN1的表達（Albert et al.，2011），而與 AtCPC 同源的 PhMYBx（R3-MYB）通過與PhAN1和PhJAF13結合，抑制花青素的合成（Koes & Verweij，2005；Zhu et al.，2009）。MYB抑制劑與MYB激活劑競爭與JAF13和AN1結合，從而減少MBW復合物的數(shù)量。除了MYB抑制劑外，還發(fā)現(xiàn)microRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平抑制花青素的生物合成。在番茄中miRNA858抑制了R2R3-MYB激活劑的表達（Jia et al.，2015）。

2.3.2 植物花色苷合成的環(huán)境調(diào)控 花色苷的合成積累受光影響較大，光照強度和波長都會不同程度地影響花色苷合成過程，但波長起著更為關鍵的作用（胡可 等，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，強光調(diào)控花色苷的產(chǎn)生主要是通過調(diào)控R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子來實現(xiàn)（Albert et al.，2009），茄屬植物中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SlAN2在強光下可引導番茄中的花色苷含量上升（Kiferle et al.，2015），辣椒中CaMYBA在強光下表達量上調(diào)（Lightbourn et al.，2007），致使花色苷含量增加；R2R3-MYB抑制劑PhMYB27在強光下表達量下調(diào)（Albert et al.，2011），促進矮牽?；ㄉ蘸铣?。光質(zhì)對花色苷生物合成基因的影響在茄科蔬菜中的研究較少，但在矮牽牛中，藍光和紅光與黑暗條件相比，可以誘導CHS基因表達（Katz & Weiss，1999）。MYB類轉(zhuǎn)錄因子中一部分受環(huán)境影響，光通過激活光敏色素PHY、隱花色素CRY、光受體UVR8控制COP1從而影響MYB類調(diào)控因子的表達，目前尚無明確證據(jù)表明COP1是否受其他環(huán)境因素影響果實中花色苷的生物合成（圖4）。藍光在歐洲油菜中誘導BnCRY1基因的轉(zhuǎn)錄，長時間的藍光照射使得積累的CRY 1蛋白水平較低，花色苷含量下降（Chatterjee et al.，2006）。煙草葉片中花色苷生物合成基因在光照下上調(diào)表達，在黑暗中下調(diào)表達。煙草CaMV35S啟動子控制馬鈴薯StMYBA1基因在煙草葉片中的瞬時表達（Liu et al.，2017）。在整個生育期中用不同的光照條件對紫色馬鈴薯進行照射，4 h光照處理下紫色馬鈴薯塊莖成熟期苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性較2 h光照處理提高了2.74%，且PAL活性和光照強度、時間呈正相關，證明了光影響PAL活性，從而影響紫色馬鈴薯中花色苷的含量（吳翠萍，2016）。

圖4 果樹花色苷生物合成發(fā)育與環(huán)境調(diào)控的簡化模型（Jaakola，2013）

溫度是影響花色苷代謝的另一個主要環(huán)境因素，高溫影響花色苷合成相關酶的活性，促進花色苷的水解。研究表明，植物在碳水化合物不足時，會使花色苷的糖苷鍵水解，為植物提供能量，導致植物有高溫褪色的現(xiàn)象（羅蘭，2007）。高溫下蘋果內(nèi)花色苷濃度的降低可能與Ⅲ類過氧化物酶活性的提高和過氧化氫水平的升高有關。然而，通過過氧化物酶抑制劑，盡管高溫下過氧化氫水平較高，但35 ℃處理的花色苷含量增加甚至高于20 ℃處理。因此，過氧化物酶活性的提高有助于降低高溫下花色苷的含量（Niu et al.，2017）。在茄子的研究中發(fā)現(xiàn)，EBGs（SmCHS、SmCHI、SmF3H）比LBGs（SmF3′5′H、SmDFR、SmANS）對低溫的反應更敏感（Jiang et al.，2016）。長日照處理下的彩色馬鈴薯塊莖成熟期花色苷含量較短日照處理提高了1.93%（吳翠萍，2016）。高溫主要抑制紫甘薯下游基因DFR和F3H的表達，對CHS的影響較?。ɡ顕?等，2017）。

激素在花色苷的合成及調(diào)控機制中也起著十分重要的作用。Weiss等（1992）在矮牽?；ü谥邪l(fā)現(xiàn)，脫落酸可以誘導CHS、CHI、DFR、ANS基因的表達，促進花色苷的形成。但在Ronchi等（1997）的研究中呈相反的結果，脫落酸抑制玉米中花色苷的積累。研究表明，脫落酸可以通過抑制植物體中葉綠素降解來抑制花色苷的合成，葉綠素吸收較多的紅光，與光敏色素形成競爭機制，降低光敏色素的效應，從而影響花色苷的合成（Looney，1980）。使用激素和糖處理擬南芥種子發(fā)現(xiàn)，施加赤霉素（GA）后，糖誘導的花青素苷合成途徑被抑制；而茉莉酮酯酸（jasmonic acid，JA）和脫落酸（abscisic acid，ABA）卻能與糖協(xié)同作用于花青素苷合成途徑（Loreti et al.，2008）。乙烯可以促進PAL的活性，同時增加細胞膜的透性，促進糖運轉(zhuǎn)速率，利于花色苷合成（李平 等，1999）。在植物體花色苷的合成過程中并不取決于某種單一的激素的作用，而是取決于各種激素的某種平衡。激素之間起著增效、拮抗、誘導和反饋等作用，在植物體內(nèi)共同調(diào)節(jié)花色苷的合成過程。

3 展望

花色苷具有較高抗氧化能力、較好的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在保健、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)中有廣泛的應用前景。但花色苷合成基因在不同物種、不同器官和組織之間具有時空表達差異性，受不同MYBs組成的MBW復合物控制。紫甘薯、彩色馬鈴薯等塊根塊莖類作物花色苷含量高，應用前景大，但是有關其花色苷生物合成相關轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控的分子機制尚不明確，地下器官花色苷生物合成相關關鍵基因的克隆與利用及分子調(diào)控機制的解析仍將是將來研究的重點，研究結果不但可以豐富植物花色苷生物合成調(diào)控機理的理論，同時為加速培育高花色苷作物新品種提供理論指導和基因資源。隨著分子生物學技術的發(fā)展，采用基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組學、基因編輯等技術，對高花色苷含量的紫甘薯、彩色馬鈴薯資源進行深入研究，挖掘地下器官花色苷關鍵合成基因及調(diào)控基因，通過遺傳操作調(diào)控花色苷的合成、提高植物地下器官的花色苷含量和產(chǎn)量已成為可能。