正交設(shè)計(jì)優(yōu)選黃芪總黃酮提取工藝

梁泰帥 趙肖瓊2 馮 美

1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001；2.太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008

黃芪是山西的一種重要道地藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、性溫，具有補(bǔ)氣固表、排膿降壓、提高機(jī)體免疫力等功效，素有“十藥八芪”之稱[1]。黃酮類(lèi)化合物是黃芪發(fā)揮功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和有效部位，可作為抗氧化劑在清除活性氧自由基、抗菌消炎、延緩衰老、抗過(guò)敏等方面有著顯著的藥理活性，并已在臨床防治老年高血壓、冠心病和視網(wǎng)膜出血等疾病方面有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。因此，優(yōu)化黃芪總黃酮的提取工藝對(duì)其藥理學(xué)作用的深入探究意義重大。本研究分別對(duì)乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定四因素三水平，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，考察黃芪總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，以期為黃芪資源的合理開(kāi)發(fā)以及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥 蒙古黃芪藥材飲片(山西渾源萬(wàn)生黃芪開(kāi)發(fā)有限公司)；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201610)；95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器 電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；中藥材粉碎機(jī)(FW177，天津市泰斯特儀器有限公司)；萬(wàn)分之一天平(BSA224S-CW，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2，國(guó)華電器有限公司)；循環(huán)水式真空泵[SHZ-D(Ⅲ)，上海予申儀器有限公司]；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1200，上海美譜達(dá)儀器有限公司)；低速大容量多管離心機(jī)(LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照張浩等[3]的方法，稍作改進(jìn)：準(zhǔn)確稱取在105℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25 mg于100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，得到質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7只10 mL容量瓶中，然后分別添加3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL的蒸餾水；再向各瓶?jī)?nèi)添加5%的NaNO2溶液 0.3 mL，混勻并靜置6 min；繼續(xù)添加10%的Al(NO3)2溶液 0.3 mL，混勻并靜置6 min；再添加4%的NaOH溶液4 mL，最后用70%的乙醇定容至10 mL，混勻并靜置12 min，依次在510 nm處測(cè)定各瓶?jī)?nèi)反應(yīng)液的吸光值，以吸光值Y和蘆丁質(zhì)量濃度X分別作為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=0.6804X-0.0012，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

1.3.2 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光值，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算出RSD為0.481%，表明精密度良好。

1.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品溶液制備[4]：將黃芪藥材于60℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)50目篩。精確稱取黃芪粉末5 g于圓底燒瓶中，加入10倍量90%乙醇，70 ℃水浴下回流提取2次，每次2 h，趁熱減壓抽濾2次，合并濾液，5000 r/min離心5 min，上清液即為供試品溶液。

準(zhǔn)確吸取供試品溶液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”項(xiàng)下方法分別于0、15、30、45、60、90、120 min測(cè)定吸光值，計(jì)算出RSD為1.176%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精確稱取黃芪粉末共6份，按照“1.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，各取1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光值，計(jì)算出RSD為0.912%，表明此方法重復(fù)性較好。

1.3.5 加樣回收試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量(5.198 mg/g)的黃芪粉末6份，各約2.5 g，按照“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再分別精確加入適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，混勻后按照“1.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出平均回收率為99.81%，RSD為0.805%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

1.3.6 單因素試驗(yàn) 根據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)計(jì)以下單因素試驗(yàn)組合：①乙醇濃度為50%、60%、70%、80%和90%，水浴溫度為70 ℃，料液比為1∶10，提取時(shí)間為2 h；②水浴溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，乙醇濃度為90%，料液比為1∶10，提取時(shí)間為2 h；③料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70 ℃，提取時(shí)間為2 h；④提取時(shí)間為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70 ℃，料液比為1∶10，分別考察以上各試驗(yàn)條件對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)“1.3.3”項(xiàng)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以黃芪總黃酮提取率為考量指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，選定的正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

1.4 數(shù)據(jù)分析 分別采用SPSS 18.0和Origin9.0軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)和繪圖。計(jì)算公式為[5]：

總黃酮提取率=(C×V)/(M×1000)×100

式中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL)，V表示濾液體積(mL)，M表示黃芪粉末質(zhì)量(g)，×1000表示g與mg的單位轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn) 圖1顯示，隨著乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間的增加，黃芪總黃酮的提取率均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且分別在乙醇濃度為80%、水浴溫度為90 ℃、料液比為1∶10和提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值。因此，選擇乙醇濃度70%、80%和90%，水浴溫度為80 ℃、90 ℃和100 ℃，料液比為1∶8、1∶10和1∶12，提取時(shí)間為2 h、2.5 h和3 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn) 由表3中R值(極差)可知，對(duì)黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比、乙醇濃度、水浴溫度和提取時(shí)間。從表中K1、K2、K3的大小分析得出，黃芪總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時(shí)間為2 h。此外，從表4方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度(P<0.001)、水浴溫度(P<0.01)、料液比(P<0.001)和提取時(shí)間(P<0.05)均顯著影響黃芪總黃酮的提取率。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證組合A3B1C3D1為最優(yōu)提取方案，在此條件下，平行試驗(yàn)3次，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，可以看出，在此最優(yōu)提取條件下，黃芪總黃酮的平均提取率為0.286%，均高于單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，表明該提取工藝參數(shù)A3B1C3D1(即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時(shí)間為2 h)合理可行，為黃芪總黃酮最優(yōu)提取方案。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

注：*，差異顯著水平為P<0.05；**，差異顯著水平為P<0.01；***，差異顯著水平為P<0.001。

表5 驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

相比于微波輔助萃取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法等，黃酮類(lèi)物質(zhì)的乙醇回流提取法操作簡(jiǎn)便、效率較高、溶劑可回收、運(yùn)行成本低，能夠同時(shí)兼顧提取效率和工業(yè)化生產(chǎn)[4,6]。本試驗(yàn)選擇乙醇回流提取法進(jìn)行黃芪總黃酮提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法研究乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)黃芪總黃酮提取率的影響，并通過(guò)直觀分析和方差分析綜合考察，確定黃芪總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)[6]。單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪總黃酮提取率均隨乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時(shí)間的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，表明影響總黃酮提取率的4個(gè)因素在選定范圍內(nèi)均存在顯著最佳值，當(dāng)各影響因素設(shè)定水平高于最佳值時(shí)，較高濃度的乙醇溶液使藥材中的低極性雜質(zhì)易于滲出[5]，造成類(lèi)黃酮提取效率降低，高溫可破壞類(lèi)黃酮類(lèi)化合物的分子結(jié)構(gòu)[4]，而料液比和提取時(shí)間的增加又導(dǎo)致生產(chǎn)成本以及提取周期提高[7]；反之，當(dāng)各影響因素設(shè)定水平低于最佳值時(shí)，導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)的滲透、溶解和擴(kuò)散效率降低[8]，浸提物提取不充分。

試驗(yàn)研究結(jié)果表明，對(duì)黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比>乙醇濃度>水浴溫度>提取時(shí)間，同時(shí)總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時(shí)間為2 h，該提取條件下，黃芪總黃酮提取率為0.286%。此方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定合理，可作為黃芪總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)。