福建省南美白對(duì)蝦幼體急性肝胰腺壞死病病原分離與PCR檢測(cè)

郭書林，陳信忠，尤穎哲，陳何東，王藝紅，丁亦男，龔艷清，楊俊萍

（1.廈門海關(guān)，福建廈門 361016；2.漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建漳州 363000）

近年來新出現(xiàn)的對(duì)蝦傳染病常造成大批對(duì)蝦發(fā)病死亡，給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，其中最主要的疫病為急性肝胰腺壞死綜合征（acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS）[1]。該病主要發(fā)生于蝦苗放養(yǎng)后7～30 d，亦稱為早期死亡綜合征（early mortality syndrome，EMS）。該病從發(fā)生至今的10年間，給全球三大對(duì)蝦生產(chǎn)國——泰國、中國和越南的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成30%～40%左右的減產(chǎn)[2]，給我國海南、廣東、福建、廣西等省份的養(yǎng)殖場(chǎng)造成了嚴(yán)重影響。為此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入須通報(bào)水生動(dòng)物疫病名錄。2013年5月，國際水產(chǎn)聯(lián)盟（GAA）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）先后宣布，導(dǎo)致AHPNS的病原體是副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）的特異變種。本研究利用泰國專家Flegel等[3]報(bào)道的PCR檢測(cè)方法，對(duì)福建省多家規(guī)?；厦腊讓?duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了AHPNS檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 采集福建省9家規(guī)模化南美白對(duì)蝦苗種繁育基地的患病對(duì)蝦幼體各10只，共獲得90份樣本。VP分離純化用培養(yǎng)基：青島海博公司產(chǎn)品；PCR mix反應(yīng)液：天根生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR引物：上海生工科技有限公司合成。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀：美國ABI公司生產(chǎn)；VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)：法國生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取南美白對(duì)蝦幼體肝胰腺，按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.7—2013中的副溶血性弧菌分離純化鑒定方法，將得到的VP菌株作為PCR檢測(cè)用模板。

1.2.2 PCR檢測(cè) PCR檢測(cè)通過引物AP3F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'（SEQ ID NO:1） 和 AP3R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'（SEQ ID NO:2）擴(kuò)增質(zhì)粒pVA1的基因片段（以純化的VP作為模版），目的片段大小為336 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序、Blast比對(duì)后，確定分離所得的VP是否為攜帶質(zhì)粒pVA1的特異性VP菌株。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，抽提物 5 μL，加水補(bǔ)至 25 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃5 min，然后進(jìn)行32次循環(huán)（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃ 5 min，4 ℃ 保溫。

1.2.3 不同樣本處理方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響分析取肝胰腺，按DNA抽提試劑盒說明書提取DNA樣本，并以此作為PCR檢測(cè)模板；取肝胰腺，按1:10 的比例放入含1.5% NaCl的 TSB培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min，振蕩培養(yǎng) 5～6 h。蕩結(jié)束后，取菌液放入1.5 mL離心管中，3 000 r/min，離心5 min，棄上清，加PBS 懸浮，將增菌后的增菌液作為PCR檢測(cè)用DNA模板。將上述2種處理方式的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，分析不同樣本處理方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2.1 VP分離和PCR檢測(cè)

從9家規(guī)?；厦腊讓?duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)分別取10只患病幼蝦，共獲得90份樣本，增菌后從其中33份樣本的弧菌顯色培養(yǎng)基平板上分離到疑似VP。挑取其中5個(gè)單菌落進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)氧化酶陽性，革蘭氏染色陰性，且VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)確認(rèn)為VP。鑒定確認(rèn)的VP菌株分別來自于27份樣本，共81株（表1）。

對(duì)81株VP進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢出陽性菌株72株，PCR電泳結(jié)果見圖1。陽性菌株分別來自23份樣本，其中16份樣本的所有受檢VP菌株均為特異性菌株，6份樣本的部分受檢VP為特異性菌株，1份樣本的所有受檢VP均非特異性菌株，說明患病幼蝦肝胰腺存在不同基因型VP同時(shí)感染情況。

表1 VP分離和PCR檢測(cè)結(jié)果 單位：株/份

圖1 AP3引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2 以肝胰腺DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)

90份樣本中，8份樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性，包含于2.1結(jié)果中的22份PCR檢測(cè)特異性VP陽性樣本中，說明直接以肝胰腺DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)的方法靈敏性較低，較之于2.1方法的檢出率降低了約63%。

2.3 以肝胰腺增菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)

90份樣本中的25份樣本檢測(cè)結(jié)果為PCR陽性，其中22份樣本與2.1的檢測(cè)結(jié)果相吻合，而另3份樣本在2.1方法中的檢測(cè)結(jié)果為VP分離陽性而PCR陰性。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果略有差距。

3 討論

2014年，有關(guān)AHPNS的病原學(xué)研究取得了重要進(jìn)展，通過比較VP致病株與非致病株的基因序列，發(fā)現(xiàn)了與致病性相關(guān)的pVA1質(zhì)體，并證明致病性VP的毒素蛋白PirA和PirB是引起AHPNS的關(guān)鍵。Flegel等[3]公布了一種通過引物AP3檢測(cè)急性肝胰腺壞死病（AHPND）VP分離株的新方法。該方法基于一種12 kDa蛋白質(zhì)的基因序列，AP3引物優(yōu)于之前公布的AP2引物，與先前推薦的100%敏感性、97.7%特異性、97.4%陽性預(yù)測(cè)值和100%陰性預(yù)測(cè)值相比，新方法具有100%的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。Flegel等認(rèn)為，AP3擴(kuò)增法對(duì)細(xì)菌分離株的DNA提取液具有足夠的敏感性，不建議將此方法應(yīng)用于嵌套的PCR。但是，對(duì)于來自蝦組織、小蝦或幼蝦糞便、整個(gè)幼體和其他疑似攜帶者以及來自池塘沉積物等環(huán)境源樣品，建議在含有1.5% NaCl補(bǔ)充物的TSB中進(jìn)行初步富集，在30 ℃左右的溫度下振蕩培養(yǎng)4 h。此后，讓所有碎片沉淀，然后將混濁的上清液離心，收集細(xì)菌，丟棄上清液。從細(xì)菌顆粒中提取DNA，并使用大約100 ng的模板進(jìn)行PCR測(cè)試。本試驗(yàn)中，以從幼蝦肝胰腺中分離到的VP為DNA模板進(jìn)行PCR檢測(cè)的靈敏性高，直接以幼蝦的肝胰腺為DNA模板進(jìn)行PCR檢測(cè)的靈敏性較低，檢出率降低了63%。以肝胰腺增菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢出3份陽性樣本，但經(jīng)VP分離后再進(jìn)行PCR檢測(cè)的結(jié)果為陰性，推測(cè)可能PCR檢測(cè)試驗(yàn)中未挑取到AHPNS陽性VP，造成了漏檢。另一種可能是以肝胰腺增菌液進(jìn)行的檢測(cè)出現(xiàn)了假陽性；或者蝦體曾經(jīng)感染過AHPNS陽性VP，目前僅攜帶其DNA，而未攜帶VP活菌。因本試驗(yàn)未進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)，所以無法驗(yàn)證以肝胰腺增菌液進(jìn)行的PCR檢測(cè)與VP法的PCR檢測(cè)結(jié)果差異是否由假陽性導(dǎo)致。

將本試驗(yàn)的VP PCR檢測(cè)結(jié)果與張娜等[4]的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該方法具有很好的檢出率和靈敏性，推測(cè)原因可能是對(duì)蝦樣本的選擇不同導(dǎo)致。本試驗(yàn)中，對(duì)蝦樣本為患病幼蝦，而張娜的試驗(yàn)對(duì)象是隨機(jī)采取的親蝦，而患病幼蝦肝胰腺中AHPNS陽性VP豐度可能較高，使得AHPNS陽性VP的檢出率顯著提高。

本試驗(yàn)對(duì)福建省9家規(guī)模化對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的90份患病幼蝦樣本進(jìn)行AHPNS檢測(cè)，從27份樣本中分離鑒定出81株VP，其中從22份樣本中分離到AHPNS陽性VP，顯示發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)具有較高的VP感染風(fēng)險(xiǎn)和AHPNS暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。