河南省某蛋雞場新城疫病毒ZK1/18毒株的分離鑒定

賈松濤，劉 煒，周婷婷，張 軍

（鄭州市動物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450052）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性高度接觸性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報禽病之一，我國將其列為一類動物傳染疫病[1]。禽感染NDV的臨床特征主要是呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜漿膜出血。雞、珠雞、火雞及野鴨都對NDV易感，其中雞最易感。NDV的RNA核苷酸序列長約15 kb，整個基因組包含6個主要的ORF，即3'-NP-PM-F-HN-L-5'，F(xiàn)基因ORF全長1 662 bp，編碼553個氨基酸[2]。F蛋白（融合蛋白）是一種糖基化蛋白，位于囊膜表面的小纖突，介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，促進(jìn)病毒侵襲。F蛋白裂解位點的氨基酸序列組成是該病毒毒力的分子基礎(chǔ)[3]。國家新城疫參考實驗室自2002年成立后，已在全國各地分離到具有代表性的NDV 300多株，并建立了病毒庫及各毒株詳細(xì)的基因庫。該實驗室研究發(fā)現(xiàn)，基因VII型是目前在我國流行的優(yōu)勢基因型，所占比重逐年上升[4]，同時III、IX、VI等其他基因型也在散發(fā)流行[5-7]。

2018年3月，河南省一存欄6 000只150日齡蛋雞發(fā)生以產(chǎn)蛋下降及呼吸道癥狀為主要特征的疾病，發(fā)病率為10.0%，死亡率為1.2%。該場病雞臨床癥狀主要表現(xiàn)為：精神沉郁、咳嗽、呼吸困難，并不時發(fā)出喘鳴聲，拉黃綠色稀便；產(chǎn)蛋率下降，產(chǎn)畸形蛋、沙殼蛋、軟殼蛋。剖檢可見：呼吸道黏液增多并且輕微出血，腺胃乳頭出現(xiàn)針尖狀出血點；腸道剖檢病變集中，小腸黏膜出現(xiàn)彌漫性出血。通過臨床癥狀和剖檢病變，初步診斷為ND。該場ND免疫程序為35、80日齡“新流二聯(lián)”肌內(nèi)注射0.5 mL/只，145日齡“新支減”肌內(nèi)注射0.5 mL/只。各疫苗中ND抗原成分所用毒株均為NDV La Sota株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無菌采集病死雞的喉頭/氣管、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟及心臟等組織。

1.1.2 試驗材料 抗NDV陰性、陽性血清：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；SPF雞胚：購自乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠；Trizol LS、AMV：購自Promega公司；DH5α感受態(tài)、Ex Taq預(yù)混酶、DNA片段快速純化回收試劑盒、pMD19-T載體：購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 采集適量病死雞的心臟、肝臟及氣管等組織，加入2 mL PBS液混合研磨，離心后取上清液反復(fù)凍融3次，再離心取上清，接種3枚9日齡雞胚，每枚接種0.2 mL，石蠟封口，37 ℃孵育4 d；每隔8 h照胚，棄去24 h內(nèi)死亡胚，收集24～96 h的死胚、瀕死胚，同時收取對照正常存活雞胚，置于4 ℃冰箱過夜；無菌抽取尿囊液，每管1.5 mL，分裝后放于-20 ℃冰箱備用。盲傳3代，測定HA效價。

1.2.2 血清學(xué)鑒定 將分離毒株進(jìn)行HA及HI測定，按國家標(biāo)準(zhǔn)《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550—2008）進(jìn)行操作。

1.2.3F基因RT-PCR擴(kuò)增、克隆與鑒定 為擴(kuò)增F基因全部序列，對HN基因的部分上游片段、F基因全片段以及M基因的部分下游片段進(jìn)行引物設(shè)計。根據(jù)GenBank公布的F48E9株全基因序列（序列號MG 456905.1），設(shè)計1對引物，合成片段總長預(yù)計為1 932 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成（NDV-F1：5'-GCT CGG ACC CTC TGT GCT TGT G-3'；NDV-F2：5'-GGT TGC TTG TTC CCA GTA GTT T-3'）。采用西安天隆全自動核酸提取儀提取病毒RNA。PCR反應(yīng)條件為，95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。擴(kuò)增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收特異DNA條帶，進(jìn)行DH5感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，按說明書提取質(zhì)粒，分別作質(zhì)粒PCR及酶切鑒定。將PCR 陽性質(zhì)粒送上海生工有限公司測序，運用DNAstar、Primer軟件分析序列并構(gòu)建基因進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離及血清學(xué)鑒定

盲傳3代后，雞胚在45～65 h內(nèi)全部死亡，胚體全身充血、水腫，尤其以頭部出血最為明顯。無菌收集尿囊液測HA效價，結(jié)果均在1:64～1:256之間；將分離毒株配成4單位抗原，用NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、AI（H5、H7、H9亞型）陽性血清測其HI效價。NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清HI效價為1:1 024，AI（H5、H7、H9亞型）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清HI效價分別為0、1:4、1:2，表明所分離毒株為NDV，命名為A/Chicken/China/zhoukou1/18，簡稱ZK1/18（表1）。

表1 病毒的傳代培養(yǎng)及HI試驗結(jié)果

2.2 F基因擴(kuò)增與酶切鑒定

酶切后出現(xiàn)了2.0 kb和3.0 kb左右的條帶，與預(yù)期目的基因片段（1 932 bp）及T載體片段大小相符，說明重組質(zhì)粒中已經(jīng)成功連接了所擴(kuò)增的F基因片段（圖1）。

圖1 目的基因酶切鑒定及RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 F基因序列分析和基因進(jìn)化樹構(gòu)建

測序結(jié)果表明，所擴(kuò)增分離株基因全長1 932 bp，包含F(xiàn)基因ORF全長，與預(yù)期片段大小相符。應(yīng)用DNAstar軟件推導(dǎo)其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其F蛋白裂解位點的氨基酸順序為112R-RQ-K-R-F117，與NDV強(qiáng)毒株的分子特征相符[2]。將所測病毒分離株的F基因序列與國內(nèi)外已發(fā)表的其他NDV片段進(jìn)行序列比對，構(gòu)建包含23株NDVF基因的遺傳進(jìn)化樹（圖2）。

圖2 ZK1/18株NDV F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

對F基因進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，該毒株與國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E9及疫苗株La Sota之間的核苷酸親緣關(guān)系都相對較遠(yuǎn)，其同源性分別為85.9%、83.5%，而與新疆CJG-xinjiang- 07株同源性為99.6%，與山西株、河南株、遼寧株、寧夏株等同源性在95%～976%之間，屬于VII型，與國外分離毒株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)（圖3），說明國內(nèi)的NDV流行趨勢在地域上逐漸趨于統(tǒng)一。

3 討論

NDV為有囊膜的負(fù)鏈 RNA病毒，基因組全長有3種：15 186 bp、15 192 bp和15 198 bp。我國近年流行的NDV毒株除了經(jīng)典的基因VI型外，還出現(xiàn)了我國獨有的變異基因IX型[8]。秦卓明等[9]研究發(fā)現(xiàn)：歷史上發(fā)生的4次ND大流行都出現(xiàn)了不同的基因型，并且每次流行均以新基因型為主；NDV毒株的基因型進(jìn)化在全世界不同地區(qū)存在不同程度的同步現(xiàn)象；20世紀(jì)90年代的ND大流行主要由基因VII型引起[10]。

本次分離的新城疫病毒屬于基因VII型，該基因型在我國大陸地區(qū)首次報道于2000年[11]。研究發(fā)現(xiàn)，大陸VIId亞型NDV源于我國臺灣地區(qū)的TW98/4株，后相繼演變?yōu)镃h97/1、Ch98/3、Ch/99、Ch/2000等VIId亞型，是造成我國大陸地區(qū)1998—2000年ND暴發(fā)的代表毒株[12]。ZK1/18分離株與新疆、西藏、山西、河北、浙江等地分離的NDV毒株同屬于VII型，進(jìn)而推斷VII型在河南省仍是引起ND疫情的主導(dǎo)基因型。

本次新城疫疫情發(fā)生的原因可能有兩個方面：一方面雞群處于產(chǎn)蛋初期，機(jī)體本身有一定的應(yīng)激反應(yīng)，加之春季氣候不穩(wěn)定，養(yǎng)殖戶疏于管理，冷空氣侵襲時造成雞群抵抗力降低；另一方面由于雞群免疫程序中使用的疫苗株La Sota株屬于基因II型，對基因VII型野毒的侵襲可能不會完全抵御。因此，廣大養(yǎng)殖戶做好禽群免疫和飼養(yǎng)管理的同時，要結(jié)合氣候變化，適時通風(fēng)，做好場區(qū)和雞舍消毒工作。

圖3 ZK1/18株與其他毒株F基因同源性分析