基于RIL群體鑒定棉花抗黃萎病相關(guān)QTLs

魯寧寧，趙云雷，王紅梅，陳偉，趙佩，龔海燕，崔艷利，桑曉慧，張凱

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州大學(xué)研究基地，河南 安陽(yáng) 455000）

棉花在我國(guó)的種植歷史長(zhǎng)達(dá)2 千多年[1]。然而，在我國(guó)棉花種植業(yè)快速發(fā)展的過(guò)程中，黃萎病的傳入與爆發(fā)給我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[2]。數(shù)十年來(lái)，棉花科研人員圍繞棉花黃萎病菌及其致病機(jī)理[3-4]、棉花對(duì)黃萎病的抗性遺傳機(jī)理[5-7]、棉花抗黃萎病相關(guān)基因的數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait loci，QTLs）分析[8-9]以及抗黃萎病相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化、表達(dá)和功能分析[10-12]等方面進(jìn)行了多方位研究，試圖從遺傳育種的角度解決這一世界性病害。

棉花黃萎病由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaKleb.）和黑白輪枝菌（V.albo-atrum）引起，這2 種真菌侵入棉花后會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶、蛋白酶以及毒素等致病因子，造成棉花維管束堵塞、細(xì)胞壞死及棉花相關(guān)防衛(wèi)蛋白的降解[13-14]，從而導(dǎo)致棉花枯萎死亡。如今，普遍認(rèn)為陸地棉對(duì)黃萎病的抗性屬于數(shù)量性狀[15]。國(guó)內(nèi)外許多研究報(bào)道利用分子標(biāo)記技術(shù)定位與棉花抗黃萎病性相關(guān)的 QTLs 并取得一定進(jìn)展，Wang 等[16]、杜威世等[17]、葛海燕 等[18]、Zhang 等[19]、蔣 鋒[20]、孔祥瑞[21]、王芙蓉等[22]以及楊昶等[23]均利用分子標(biāo)記對(duì)種間雜交配制的F2、F2∶3或回交自交系（Back-cross inbred lines，BIL）等群體進(jìn)行棉花抗黃萎病相關(guān)基因QTLs 定位研究，分別獲得了1～41個(gè) QTLs 或分子標(biāo)記。目前，定位出的QTLs 已達(dá)100 多個(gè)，但能夠穩(wěn)定表達(dá)并應(yīng)用于抗黃萎病育種的極少。

以上研究所用群體多為暫時(shí)性分離群體，暫時(shí)性分離群體與永久性群體相比其株系內(nèi)還未達(dá)到基因型純合，因此不能永久使用，而永久性群體能夠?qū)TLs 在多個(gè)環(huán)境下進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)，可排除單個(gè)環(huán)境的影響從而定位出穩(wěn)定表達(dá)的QTLs。因此，本研究以抗×感陸地棉品種配制的高代重組自交系 （Recombinant inbred lines，RILs）為作圖群體，利用SSR 分子標(biāo)記在多年多個(gè)環(huán)境下對(duì)棉花抗黃萎病相關(guān)基因進(jìn)行QTLs 檢測(cè)，以期能夠鑒定出幾個(gè)可穩(wěn)定表達(dá)的棉花抗黃萎病相關(guān)QTLs。

1 材料與方法

1.1 親本及群體材料

親本?？姑蓿–K）是我國(guó)江蘇常熟市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)指導(dǎo)站培育的抗落葉型黃萎病陸地棉品種，為抗病親本，TM-1 是陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系，為感病親本。2001年對(duì)雙親做品種間雜交，產(chǎn)生的F1種子自交獲得 F2種子。2002年，F(xiàn)2單株自交獲得 F2∶3家系； 到2010年獲得高代遺傳分離的F6∶7株系，包含 111個(gè)家系；2015年以 F7單株自交獲得 F7∶8家系；2016年以 F8的種子種植獲得 F8∶9家系。

1.2 引物多態(tài)性篩選及群體基因型檢測(cè)

對(duì)親本及群體家系抽提DNA，提取方法參照宋國(guó)立等[24]改良的CTAB 法并稍加修改。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）引物包括本課題現(xiàn)有保存的引物、新合成的前人已定位出的標(biāo)記引物以及由本所野生棉課題組劉方老師提供的引物，包括 SWU、CCRI、BNL、CGR、DPL、Gh、HAU、JESPR、MGHES、MUSS、STV、NAU 及 TMB 系列部分引物，詳見(jiàn)表1。

SSR 引物多態(tài)性篩選及群體基因型檢測(cè)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。

1.3 抗病性鑒定

病圃（BP）環(huán)境下于2010年在河南安陽(yáng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所南試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)對(duì)111個(gè)RILs 株系進(jìn)行抗病性鑒定，單行區(qū)種植，3 次重復(fù)，以冀棉11 為感病對(duì)照，豫棉2067 為抗病對(duì)照，隨機(jī)排列。病圃為長(zhǎng)20 m、寬2.5 m 人工接菌感染的水泥池。病原菌為中等致病力的安陽(yáng)菌系Vd076，于成株期對(duì)其進(jìn)行1 次病指統(tǒng)計(jì)。

大田環(huán)境下分別于2010年、2015年在河南安陽(yáng)（AY）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所白壁東試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，2016年在新疆（XJ）南疆阿拉爾實(shí)驗(yàn)站的黃萎病重病地進(jìn)行抗病性鑒定，均為單行區(qū)種植，設(shè)3 次重復(fù)，隨機(jī)排列。

分別于 2010年6月21日、8月2日和 9月2日，2015年7月15日和 8月27日，2016年7月9日和8月25日共進(jìn)行7 次病情調(diào)查。病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22101.5―2009 《棉花抗病蟲(chóng)性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第5 部分：黃萎病》[25]。病情指數(shù)（Disease index，DI）計(jì)算方法參照公式：DI＝（∑L×NL/N×4）×100.式中，L為病害級(jí)數(shù)，NL為每級(jí)的病株數(shù)，N為調(diào)查總株數(shù)。

1.4 遺傳圖譜構(gòu)建及QTLs 定位

采用 QTL IciMapping 4.0 軟件的 MAP 功能構(gòu)建遺傳圖譜，用繪圖軟件MapChart2.2 繪制遺傳圖譜，用QTL IciMapping 4.0 軟件的BIP 功能，選擇完備復(fù)合區(qū)間作圖法（Inclusive composite in terval mapping，ICIM）的加性效應(yīng)模型 ICIMADD，在對(duì)數(shù)優(yōu)勢(shì)比（logarithm of the odd score，LOD）≥2.5 時(shí)，分別利用各個(gè)環(huán)境的抗病性鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行QTLs 定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本SSR引物篩選結(jié)果

利用13 242 對(duì)不同系列的SSR 標(biāo)記引物對(duì)?？姑藓蚑M-1 進(jìn)行初步篩選，共獲得114 對(duì)在雙親間表現(xiàn)多態(tài)的引物，其多態(tài)率為0.79%（表1）。不同系列的引物多態(tài)率有所差異，多態(tài)率最低的是SWU 系列的引物，為0.40%，而 NAU 系列的多態(tài)率最高，為2.16%。這可能與引物開(kāi)發(fā)有關(guān)，SWU 系列引物是根據(jù)雷蒙德氏棉開(kāi)發(fā)的，因而在本研究陸地棉×陸地棉群體中多態(tài)率較低。

表1 親本SSR 引物篩選結(jié)果及引物多態(tài)率Table 1 Screening results of SSR primers of parental and polymorphism of primers

2.2 群體抗病性鑒定

對(duì)群體及其親本抗病性鑒定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表2）表明，8個(gè)環(huán)境下雙親抗病性均存在極顯著差異，可對(duì)其分離群體進(jìn)行抗病性的標(biāo)記分析。由RIL 群體的平均病指、最小值和最大值可知，2010年6月21日病情最輕，2010年9月2日病情最為嚴(yán)重，2016年8月25日及2015年8月27 病情也較為嚴(yán)重。因 2010年6月21日和2010年8月2日所有材料均表現(xiàn)抗病級(jí)別，不合實(shí)際；所以將其結(jié)果排除。其余各日期調(diào)查數(shù)據(jù)的峰度和斜度絕對(duì)值均小于1 （表2），說(shuō)明其分布服從連續(xù)性正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀分布特點(diǎn)。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用在親本間具有多態(tài)性的114 對(duì)共顯性SSR 引物，對(duì)作圖群體RILs 的111個(gè)株系進(jìn)行基因型檢測(cè)，獲得114個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性位點(diǎn)。對(duì)這些多態(tài)性SSR 標(biāo)記按1∶1 的孟德?tīng)栠z傳分離比進(jìn)行卡方（χ2）檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有58個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為顯著偏分離（P＜0.05），且在構(gòu)建圖譜時(shí)有51個(gè)偏分離標(biāo)記聚集在同一連鎖群上。為減小偏分離標(biāo)記對(duì)QTLs 定位的影響，我們將卡方值大于6，即偏分離表現(xiàn)極顯著（P＜0.01）的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行篩選取舍，刪除嚴(yán)重偏分離標(biāo)記52個(gè)，保留輕微偏分離標(biāo)記6個(gè)。利用QTL IciMapping 4.0 軟件的MAP 功能對(duì)篩選后的標(biāo)記進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建，最終獲得1 張包含 12個(gè)連鎖群、40個(gè) SSR標(biāo)記、全長(zhǎng)212.5 cM（厘摩）的遺傳圖譜。在CottonFGD[26]網(wǎng)站上，對(duì)進(jìn)入連鎖圖譜的SSR 序列進(jìn)行 BLAST 分析，通過(guò)與陸地棉參考基因組（genome，G.hirsutum(AD1)，NAU，26 Chrs＋38951 scaffolds）[27]比對(duì)，確定其在染色體上的物理位置，從而將12 條連鎖群分別錨定在10 條染色體上（圖1）。其中，分別有2個(gè)連鎖群同時(shí)錨定在A09和D07 染色體上。

2.4 QTLs分析

利用 2010年病圃及 2010年9月2日、2015年7月15日和 2016年8月25日病指數(shù)據(jù)分析檢測(cè)，各得到1個(gè)QTL 位點(diǎn)，分別位于染色體A09、D01、D05和A05 上；利用 2016年7月9日的病指數(shù)據(jù)分析檢測(cè)得到3個(gè)QTLs 位點(diǎn)，其中1個(gè)位于 A09 染色體，2個(gè)位于 D05 染色體。其中，qVR-D05-1 同時(shí)在 2015年7月15日和 2016年7月9日2個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到，其物理區(qū)間約為1.35 Mbp。這6個(gè) QTLs 的左右標(biāo)記距離分布在 0.9～17.3 cM 不等；LOD值分布在 2.51～5.55；貢獻(xiàn)率最小為6.93%，最大為 20.96%，其中有6個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到的QTLs 貢獻(xiàn)率在10%以上 （表3）。6個(gè) QTLs 中有 2個(gè)位于染色體D05，2個(gè)位于染色體 A09，1個(gè)位于 D05 的同源染色體 A05 上。與 QTLs 緊密連鎖的 SSR 標(biāo)記信息見(jiàn)表4。

表2 8個(gè)環(huán)境下RIL 群體及其親本的抗病性表現(xiàn)Table 2 The disease resistance of RIL population and its parents in 8 environments

圖1 陸地棉重組自交系群體分子標(biāo)記連鎖圖Fig.1 Genetic linkage map based on RIL population of G.hirsutum

表3 完備復(fù)合區(qū)間作圖法分析檢測(cè)到的抗病QTLsTable 3 QTLs of disease-resistance detected by the Inclusive Composite Interval Mapping method

表4 與QTLs 緊密連鎖的SSR 標(biāo)記信息Table 4 SSR marker information linked closely with QTLs

表4 （續(xù)）Table 4 （Continue）

3 討論與結(jié)論

3.1 SSR標(biāo)記在構(gòu)建連鎖圖譜中的應(yīng)用

第二代分子標(biāo)記SSR 在棉花抗黃萎病以及棉花的其他數(shù)量性狀如早熟，纖維品質(zhì)等的定位中已得到廣泛而充分的應(yīng)用，其操作簡(jiǎn)便且成本低。葛海燕等[18]利用抗黃萎病品系常96 和感病品種軍棉1 號(hào)配制的F2群體，對(duì)1 998 對(duì) SSR 引物進(jìn)行篩選后獲得148個(gè)SSR 多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，結(jié)合 6個(gè)相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP） 標(biāo)記構(gòu)建了 1 張含122個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的陸地棉×陸地棉雜種遺傳連鎖圖。楊昶等[23]利用2個(gè)抗、感陸地棉品種（系）配制的RIL 群體，以及5 300 對(duì)SSR 引物篩選親本后得到的115個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，構(gòu)建了1 張含有99個(gè) SSR 位點(diǎn)、21個(gè)連鎖群、全長(zhǎng) 560.1 cM 的遺傳圖譜。

本研究中利用1 萬(wàn)多對(duì)不同系列的SSR 引物對(duì)陸地棉種間雜交群體進(jìn)行了分子標(biāo)記分析，最終獲得114個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)標(biāo)記。利用在親本間具有多態(tài)性的114 對(duì)共顯性SSR 標(biāo)記構(gòu)建了1張包含12個(gè)連鎖群、40個(gè)SSR 標(biāo)記、全長(zhǎng)212.5 cM 的遺傳圖譜，其中52個(gè)SSR 標(biāo)記因偏分離較為嚴(yán)重而被剔除。由于海島棉對(duì)棉花黃萎病具有較高的抗性，我們依據(jù)雷蒙德氏棉D(zhuǎn) 組的13 條染色體設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了SWU 系列引物，且陸地棉遺傳背景狹窄，用陸地棉配制的高代重組自交系群體遺傳背景進(jìn)一步縮小，造成群體后代的引物多態(tài)率較低，因此，SWU 系列的引物多態(tài)率僅為0.40%，屬正常情況。而來(lái)源于陸地棉EST-SSR序列或基因組SSR 序列的NAU 和BNL 等系列的引物多態(tài)率較高一些。

3.2 標(biāo)記偏分離對(duì)連鎖圖譜構(gòu)建的影響

偏分離現(xiàn)象在多種作物如小麥[28]，水稻[29]，玉米[30]等中均有發(fā)生，在棉花的分離群體中也較常見(jiàn)[31-32]，表現(xiàn)為觀察到的基因型分離比例不遵循孟德?tīng)柗蛛x比，偏離預(yù)期理論比例，從而不能采用傳統(tǒng)遺傳模型和理論方法進(jìn)行分析[33]。劉剛等[28]以普通小麥和斯卑爾脫小麥雜交獲得的F6重組近交系為材料，構(gòu)建了1個(gè)包含287個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記的遺傳圖譜，對(duì)以上標(biāo)記的偏分離分析發(fā)現(xiàn)有82個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離 （P＜0.05），其中偏向母本的標(biāo)記共33個(gè)，占40.2%，偏向父本的標(biāo)記共49個(gè)，占59.8%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了6個(gè)分布于5 條不同的染色體上的偏分離熱點(diǎn)區(qū)域。戎福喜等[31]以海陸漸滲系13-1 和陸地棉遼棉12 構(gòu)建的F2群體為材料，利用4 500 對(duì)中具有多態(tài)性的84 對(duì)SSR 引物進(jìn)行群體間分析，其中共有19個(gè)分子標(biāo)記表現(xiàn)偏分離，偏分離標(biāo)記占總標(biāo)記的25.3%。

本研究中所獲得的114個(gè)分子標(biāo)記中有58個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為顯著偏分離，占多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)的50.88%，偏分離比例較高，這可能是由于本研究所用RIL 群體親本均為陸地棉品種，親緣關(guān)系近且群體較小，在構(gòu)建過(guò)程中受到自然環(huán)境和人為選擇的影響而產(chǎn)生偏向，也可能與配子體基因型選擇和偏分離位點(diǎn)的存在有關(guān)。為避免偏分離的影響，防止檢測(cè)到錯(cuò)誤的QTLs，我們將嚴(yán)重偏分離標(biāo)記分析比較后剔除52個(gè)較為顯著且形成聚集區(qū)的標(biāo)記，保留6個(gè)輕微偏分離進(jìn)入遺傳圖譜。雖然標(biāo)記偏分離較為嚴(yán)重且形成聚集區(qū)時(shí)會(huì)導(dǎo)致連鎖群標(biāo)記相對(duì)位置錯(cuò)誤且影響遺傳距離的估算，但我們?nèi)哉J(rèn)為本研究中的52個(gè)偏分離標(biāo)記涉及到大量的遺傳信息，同時(shí)，有研究者認(rèn)為偏分離標(biāo)記是推動(dòng)生物進(jìn)化的動(dòng)力，其經(jīng)過(guò)矯正后在QTLs 定位中依然具重大意義[34]，因此，我們后期將對(duì)嚴(yán)重偏分離標(biāo)記進(jìn)行矯正，并進(jìn)一步開(kāi)展圖譜重構(gòu)建研究。

3.3 作圖方法選擇及穩(wěn)定的QTLs的鑒定

QTLs 連鎖作圖建立在不同標(biāo)記基因型性狀的分布、平均數(shù)及方差的差異基礎(chǔ)之上[35]，數(shù)量性狀與標(biāo)記間的連鎖分析最早采用單標(biāo)記分析法，早期的QTLs 定位研究多采用這種方法，而后陸續(xù)出現(xiàn)了Lander 和Bostein 提出的基于2個(gè)側(cè)鄰標(biāo)記的區(qū)間作圖法 （Interval mapping，IM）、Zeng 提出的基于多元線性回歸與區(qū)間作圖相結(jié)合的復(fù)合區(qū)間作圖法 （Composite interval map ping，CIM）以及王建康提出的 ICIM；ICIM 具有較低的抽樣誤差和較高的作圖效率，對(duì)QTLs 具有較高的檢測(cè)功效[36]?？紫槿鸬萚21]利用單因子方差分析對(duì)以RILs 為作圖群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜進(jìn)行分析，檢測(cè)到21個(gè)顯著性標(biāo)記，利用復(fù)合區(qū)間作圖法可以檢測(cè)到2個(gè)試驗(yàn)環(huán)境條件下共6個(gè)陸地棉抗黃萎病相關(guān)QTLs。吳翠翠等[37]利用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)海陸F2群體進(jìn)行QTL 定位，共檢測(cè)到12個(gè)抗黃萎病相關(guān)QTLs。張興居[38]利用完備復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)苗期黃萎病病指在F2∶3中進(jìn)行QTLs 定位，共檢測(cè)到2個(gè)苗期抗病相關(guān)QTLs，貢獻(xiàn)率分別 22.97%、14.39%。

本研究中所采用的QTLs 定位方法為基于IciMapping 4.0 軟件的 ICIM，共檢測(cè)出 8個(gè)QTLs，LOD值的范圍為 2.51～5.55，標(biāo)記區(qū)間最小為 0.9 cM。其中，qVR-D05-1 同時(shí)在 2015年7月15日和2016年7月9日 2個(gè)環(huán)境中檢測(cè)出，其PVE 值均大于10%，說(shuō)明此QTL 表現(xiàn)較為穩(wěn)定。與前人已定位出的分子標(biāo)記進(jìn)行比較，我們發(fā) 現(xiàn) qVR-D05-1 及 qVR-D01-1 的 左 標(biāo) 記BNL3452和BNL1454 以 及 qVR-D09-2 的 右 標(biāo)記BNL3874 均在王紅梅[15]的研究中以單標(biāo)記分析法被檢測(cè)出來(lái)。因此，本研究獲得的qVRD05-1、qVR-D01-1、qVR-D09-2 及與其緊密連鎖的SSR 標(biāo)記將為棉花抗黃萎病相關(guān)QTLs 分析以及棉花分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，我們 推 測(cè) 在 D05：2 313 172 ～3 777 272 bp（1.46 Mbp）片段內(nèi)存在棉花抗黃萎病基因。今后，我們將通過(guò)生物信息學(xué)及分子標(biāo)記方法對(duì)該片段做更精細(xì)的定位。