陸地棉無(wú)絨突變體miRNA的鑒定及其靶標(biāo)基因分析

王金金，馬啟峰，倪志勇，范術(shù)麗*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000）

棉花是紡織工業(yè)的主要原料，是最大的天然纖維來(lái)源，對(duì)我國(guó)及世界的經(jīng)濟(jì)都起著重要作用[1]。棉纖維的分化和起始是影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，開(kāi)花前或開(kāi)花當(dāng)天所形成的突起以后發(fā)育成長(zhǎng)纖維，開(kāi)花后3 d 形成的突起發(fā)育成短絨，因此纖維原始細(xì)胞突起的時(shí)間、多少直接決定棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量[2-4]。通過(guò)對(duì)突變體研究，目前比較接受的觀點(diǎn)是棉花的短絨主要受顯性光子基因N1或隱形光子基因n2控制[5]。Wan 等[6]通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法驗(yàn)證N1基因就是Gh-MML3_A12，該基因組位點(diǎn)的反義鏈也轉(zhuǎn)錄，形成順式天然反義轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而影響短絨的形成。自1973年Kohel 報(bào)道N1基因以來(lái)[7]，經(jīng)歷 43年后終于將該基因克隆得到并進(jìn)行功能驗(yàn)證，而同樣控制短絨的n2基因至今未克隆得到。

microRNA（miRNA）是一種單鏈不編碼蛋白的小分子RNA，在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。秀麗隱桿線蟲(chóng)中的lin-4 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA[8]，由于miRNA 長(zhǎng)度只有20～24 nt (nucleotide)，且作用時(shí)間短暫，具有一定的隱蔽性[9]，直到 2002年，miRNA 在模式植物擬南芥中首次被報(bào)道[10]。植物中的miRNA 大部分位于基因間隔區(qū)[11]，miRNA 的生物合成過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄、加工和復(fù)合體裝載3個(gè)基本過(guò)程，是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程[12]。miRNA 經(jīng)由 RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄和核酸內(nèi)切酶（DICER-LIKE1，DCL1）切割，再由S- 腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移酶 （HUA ENHANCER1，HEN1） 進(jìn)行甲基化修飾，形成成熟miRNA[13-15]。成熟體miRNA招募 AGO（Argonaute）蛋白并形成復(fù)合體 （miRNA-induced silencing complex，RISC）[11]。最后 RISC 通過(guò)切割靶標(biāo)mRNA 或是抑制靶標(biāo)翻譯來(lái)負(fù)調(diào)控編碼基因的表達(dá)[11,16]。

在棉花中，miRNA 參與許多生物合成和代謝過(guò)程，包括胚胎的形態(tài)學(xué)建成、棉纖維和花器官的發(fā)育、病蟲(chóng)害脅迫和高溫高鹽干旱脅迫應(yīng)答[17-24]。Barozai 等[25]用擬南芥中已知 pre-miRNA比對(duì)棉花EST 數(shù)據(jù)庫(kù)的方法鑒定了22個(gè)miRNA，屬于13個(gè)家族 ，其中有7個(gè) miRNA（miR160、164、827、829、836、845和865） 第一次在棉花中被發(fā)現(xiàn)。Wang 等[26]以EST 數(shù)據(jù)庫(kù)為參考，通過(guò)同源基因搜索和實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證方法檢測(cè)出49個(gè)MiRNA 家族的73個(gè) miRNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，Gong 等[27]用深測(cè)序方法從二倍體雷蒙德氏棉和亞洲棉中分別鑒定出 122個(gè)和127個(gè)miRNA，其中有 33個(gè)屬于保守miRNA。Liu 等[28]利用高通量測(cè)序方法從海島棉胚珠和纖維中得到47個(gè)保守MiRNA 家族、7個(gè)新的 miRNA，其中 miR160、miR167、miR171、miR172和miR827 在棉纖維起始階段表達(dá)量高，說(shuō)明這些miRNA 可能參與纖維發(fā)育過(guò)程。

利用小RNA 測(cè)序技術(shù)在棉花中挖掘miRNA 基因的報(bào)道已越來(lái)越多[29-31]。新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮是一種有長(zhǎng)纖維無(wú)短絨突變體，其表型與顯性光籽突變體N1類(lèi)似，2002年在新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨無(wú)絮棉田里發(fā)現(xiàn)[32]。目前對(duì)陸地棉纖維突變體的研究大多集中在徐州142 無(wú)絨無(wú)絮、顯性光籽突變體N1和隱形光籽突變體n2中[6,33-34]。本研究以新鄉(xiāng)小吉及其無(wú)絨有絮突變體開(kāi)花當(dāng)天的胚珠為材料，構(gòu)建小RNA 文庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)小RNA 進(jìn)行分離和鑒定，挖掘纖維起始相關(guān)的小RNA 及其靶基因，為纖維起始相關(guān)基因的篩選及今后棉纖維發(fā)育研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和RNA提取

試驗(yàn)所用的材料為新鄉(xiāng)小吉的野生型（Wild type，WT）及其無(wú)絨有絮突變體（Fuzzless mutant，F(xiàn)LM）（圖1），其中新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮是一種有長(zhǎng)纖維無(wú)短絨突變體，屬于纖維起始發(fā)育突變體。新鄉(xiāng)小吉與新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮的成熟種子表面僅存在一個(gè)表型的差異，即短絨的有無(wú)，且這兩個(gè)材料為近等基因系。材料種植于河南安陽(yáng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)基地，每個(gè)小區(qū)單行種植，3 次重復(fù)，常規(guī)大田管理。摘取兩個(gè)材料開(kāi)花當(dāng)天的胚珠，立即投入到液氮中，之后放于－70 ℃超低溫冰箱保存。進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。新鄉(xiāng)小吉的野生型開(kāi)花當(dāng)天胚珠的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為 WT-1、WT-2和WT-3，新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮突變體開(kāi)花當(dāng)天胚珠的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為 FLM-1、FLM-2和FLM-3。

采用Trizol RNA試劑盒 （Invitrogen，CA，USA） 分別提取兩個(gè)材料開(kāi)花當(dāng)天胚珠總RNA。用 Bioanalyzer 2100（Agilent，CA，USA）和 RNA 6000 Nano LabChip Kit（Agilent，CA，USA） 測(cè) 定總RNA 的質(zhì)量及純度，以保證后期測(cè)序的RNA樣品的合格性。

圖1 新鄉(xiāng)小吉WT（A 和C）和新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮FLM（B 和D）的表型Fig.1 Phenotype of WT（A and C）and FLM（B and D）

1.2 小RNA文庫(kù)構(gòu)建和數(shù)據(jù)分析

樣品檢測(cè)合格后，使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina，San Diego，USA）試劑盒構(gòu)建文庫(kù)。利用連接酶在小RNA 兩端連上特異性的接頭，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后經(jīng)PCR 擴(kuò)增，用一定濃度的PAGE 膠對(duì)PCR 產(chǎn)物切膠回收，最后溶于EB 溶液，完成文庫(kù)構(gòu)建。質(zhì)檢后在Illumina Hiseq2500 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。對(duì) Illumina 測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，首先去除接頭及低質(zhì)量的測(cè)序片段，并篩選出長(zhǎng)度在20～25 nt 的序列。同時(shí)盡可能去除 mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 等非 miRNA 序列，最后剩余的數(shù)據(jù)即Clean reads，用于后續(xù)小RNA 數(shù)據(jù)分析，這樣即完成小RNA 測(cè)序（Small RNA sequencing,sRNA-seq）工作。

1.3 miRNA的差異表達(dá)分析及靶基因預(yù)測(cè)

將Clean reads 與miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的已知miRNA 前體序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定已知miRNA 的詳細(xì)表達(dá)情況，同時(shí)得到miRNA 前體序列的長(zhǎng)度及二級(jí)結(jié)構(gòu)等信息。利用miRDeep2軟件預(yù)測(cè)新的miRNA[35]。對(duì)6個(gè)樣本中已知和新miRNA 進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，并通過(guò)TPM（Transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads）對(duì)全部miRNA 的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。算法公式：TPM=mapped readcount/Total reads×106。差異表達(dá)的 miRNA 的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05，且 |log2Fold change|≥1。

結(jié)合差異表達(dá)的miRNA 與陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 的基因序列信息，利用TargetFinder 軟件對(duì)已知和新miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)[36]。結(jié)合測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步利用Blast 軟件對(duì)篩選出的差異靶基因序列與功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)Gene Ontology（GO）及KEGG 代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，最終獲得差異靶基因的詳盡注釋信息。

1.4 miRNA熒光定量PCR分析

為了驗(yàn)證小RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取 4個(gè) miRNA（gra-MIR3476-p3、pc-5p-579-2660、tcc-miR172a_R+1_2ss1GA11TG、tcc-miR403a） 進(jìn)行熒光定量PCR （Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗(yàn)證。根據(jù)所選miRNA 的序列，設(shè)計(jì)特異性的引物。選擇snRNA U6 作為內(nèi)參，利用 Trizol RNA 試劑盒（Invitrogen，USA） 分別提取 WT和FLM 開(kāi)花當(dāng)天胚珠的總 RNA。利用 TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen Biotech Inc.，Beijing，China）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用得到的相應(yīng)cDNA 作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 驗(yàn)證。利用Transgene 公司的TransStart? Top Green qPCR SuperMix 試劑盒對(duì)特定miRNA進(jìn)行表達(dá)量分析。所選miRNA 的相對(duì)表達(dá)量采用 2-△△Ct法計(jì)算，設(shè)有 3 次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA測(cè)序基本信息

本研究構(gòu)建6個(gè)文庫(kù)進(jìn)行小RNA 測(cè)序，其中包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果顯示，6個(gè)文庫(kù)中共獲得82 761 288 條Reads，經(jīng)嚴(yán)格過(guò)濾后得到55 403 828 條 Clean reads。6個(gè)文庫(kù) Clean reads 在5 949 810～12 157 913 條之間。過(guò)濾比例在52.74%～74.54%之間，平均為66.24%。

其中堿基GC 含量最高的是在FLM-1 樣本中達(dá)41.97%，最低的在WT-3 中為39.65%，平均為41.07%，符合基因組中的GC 含量（表1）。

表1 樣本數(shù)據(jù)信息Table 1 Information of sample data

miRNA 長(zhǎng)度在不同物種間分布有所差異，在擬南芥和棉花中分布最多的為24 nt[37-38]，大豆和番茄中分布最多的為21 nt[39-40]。本研究中6個(gè)文庫(kù)中無(wú)論在野生型新鄉(xiāng)小吉還是在突變體新鄉(xiāng)小吉無(wú)絨有絮，miRNA 的長(zhǎng)度主要分布在20～25 nt，在 24 nt 出現(xiàn)高峰，所占比例最高，最高達(dá)76.7%，與之前報(bào)道的一致，其他長(zhǎng)度的miRNA 所占比例較低（圖2）。

2.2 miRNA的差異表達(dá)分析

對(duì)原始下機(jī)的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和篩選。共獲得 459個(gè) miRNA，其中 301個(gè) miRNA 可以比對(duì)到miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，屬于保守miRNA，158個(gè)miRNA 屬于新預(yù)測(cè)的 miRNA。利用 RNAfold 軟件對(duì)新預(yù)測(cè)的miRNA 的前體二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示它們均具有標(biāo)志性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。301個(gè)保守 miRNA 屬于 52個(gè)家族；459個(gè) miRNA中，相對(duì)于 WT，有 236個(gè) miRNA 在 FLM 中上調(diào)表達(dá)，223個(gè)miRNA 下調(diào)表達(dá)。

圖2 miRNA 的長(zhǎng)度分布Fig.2 Length distribution of miRNA

將獲得的 459個(gè)miRNA 用DEGseq 軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，采用TPM 法將數(shù)據(jù)歸一化處理后，篩選出P≤0.05 且 |log2Fold change|≥1 的miRNA，兩個(gè)材料中共篩選出13個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括兩個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA（PC-5p-1049_1739、PC-5p-579_2660）； 其中有 5個(gè)miRNA 在突變體材料FLM 中上調(diào)表達(dá)，8個(gè)miRNA 下調(diào)表達(dá)。又對(duì)檢測(cè)得到的13個(gè)差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行家族分析，探索其所屬的MiRNA 家族在其它物種中的存在情況，可以了解miRNA 在進(jìn)化關(guān)系上的保守性。13個(gè)差異表達(dá)的 miRNA 中 4個(gè)屬于 MiR171_1 家族，2個(gè)屬于MiR172 家族，MiR159、MiR166、MiR403 家族的各有 1個(gè)，另外 4個(gè) miRNA 屬于未知家族（表2）。

2.3 差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

近些年，高通量測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，隨之miRNA 靶基因的預(yù)測(cè)也快速發(fā)展，產(chǎn)生了很多預(yù)測(cè)miRNA 靶基因的軟件，有助于研究miRNA的具體功能。本研究利用針對(duì)植物物種的預(yù)測(cè)軟件TargetFinder 對(duì)顯著差異的13個(gè)miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，最后有161個(gè)靶基因被預(yù)測(cè)到，其中7個(gè)miRNA 的39個(gè)靶基因有注釋?zhuān)@些靶基因側(cè)重于編碼 HD-ZIP（Homeodomain-leucine zipper）、GRAS （Gibberellic acid insensitive，Repressor of GAI，Scarecrow）、AP2（APETALA2）家族的轉(zhuǎn)錄因子，并且這些靶基因的功能集中在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控階段，說(shuō)明miRNA 在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后進(jìn)程中調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因來(lái)影響棉花纖維的起始發(fā)育（表3）。

對(duì)上述靶基因進(jìn)行GO 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)Y(jié)果顯示這些差異miRNA 的161個(gè)靶基因共涉及38個(gè)GO term。其中生物學(xué)進(jìn)程中富集基因數(shù)最多的是細(xì)胞分化 （55 genes）、生物學(xué) 過(guò) 程（34 genes）、花藥發(fā)育 （24 genes）、花器官發(fā)育（23 genes）。說(shuō)明這些靶基因參與細(xì)胞分化、花藥和花器官的發(fā)育。本試驗(yàn)所用材料為開(kāi)花當(dāng)天的胚珠，而胚珠是花器官中的一部分，胚珠外表皮細(xì)胞發(fā)育成纖維，說(shuō)明預(yù)測(cè)的這些靶基因很可能參與到棉花纖維的起始階段。細(xì)胞組分中富集基因數(shù)最多的為膜的整體成分（49 genes）、細(xì)胞膜（37 genes）、細(xì)胞質(zhì)（33 genes）。分子功能中富集基因最多的為金屬離子結(jié)合（41 genes）、蛋白結(jié)合（37 genes）、ATP 結(jié)合（29 genes）（如圖3 所示）。說(shuō)明這些差異miRNA 的靶基因主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上與金屬離子及一些蛋白等結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控下游基因，進(jìn)而調(diào)控纖維發(fā)育過(guò)程。

圖3 預(yù)測(cè)的靶基因GO 功能分類(lèi)圖Fig.3 GO classification of predicted target genes

2.4 對(duì)miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證miRNA 測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用加尾法熒光定量的方法檢測(cè)gra-MIR3476-p3、pc-5p-579-2660、tcc-miR172a_R+1_2ss1GA11TG、tcc-miR403a 這 4個(gè) miRNA 的表達(dá)趨勢(shì)。4個(gè)miRNA 的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算，設(shè)有 3次技術(shù)重復(fù)，結(jié)果顯示 gra-MIR 3476-p3、

pc-5p-579-2660、tcc-miR172a_R+1_2ss1GA11TG在兩個(gè)樣本中達(dá)到了極顯著差異水平，tcc-miR403a 在兩個(gè)樣本中差異顯著，并且熒光定量中miRNA 的表達(dá)量變化趨勢(shì)與測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果一致（圖4），說(shuō)明本研究中的測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

表2 13個(gè)差異表達(dá)的miRNA 的信息Table 2 Information of 13 different expression miRNA

表3 7個(gè)差異表達(dá)的miRNA 的靶基因Table 3 Target genes of 7 different expression miRNA

表3 （續(xù)）Table 3 (Continued)

圖 4 差異表達(dá)的miRNA 的qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.4 qRT-PCR validation of differential expression miRNA

3 討論

miRNA 作為一種重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，廣泛參與植物的生長(zhǎng)和發(fā)育、形態(tài)學(xué)建成及其它耐鹽耐旱耐高溫等脅迫信號(hào)的響應(yīng)。隨著生物信息學(xué)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，已有研究表明，miRNA 參與到棉花纖維發(fā)育過(guò)程中[41]。

Zhang 等[42]發(fā)現(xiàn)miR396 的靶標(biāo)為胼胝質(zhì)合酶，并且在子葉、果枝嫩葉、花蕾、雌蕊與心皮（0 DPA）、花瓣 （0 DPA）、胚珠 （0 DPA）、胚珠 （2 DPA）、纖維（20 DPA）中均表達(dá)，表明 miR396 在棉花纖維分化和發(fā)育中起重要作用。Kwak 等[43]通過(guò)對(duì)徐州142 和徐州142 無(wú)絨無(wú)絮突變體測(cè)序發(fā)現(xiàn)，miR165/166、miR167、miR172 在突變株中表達(dá)更高。Liu 等[28]利用深度測(cè)序方法從海島棉得到 47個(gè)保守 miRNA 家族、7個(gè)新的 miRNA，發(fā) 現(xiàn) miR160、miR167、miR171、miR172、miR827 在纖維發(fā)育起始階段高表達(dá)。Naoumkina等[29]發(fā)現(xiàn)miR159 和miR164 在極短纖維突變體纖維細(xì)胞中的表達(dá)量較高，并且miR164 的靶標(biāo)NAC（Gh_D11G0347）在纖維細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)。

3.1 miRNA的靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子參與棉纖維起始發(fā)育

已有研究證明 MYB（Myeloblastosis）、NAC(NAM/ ATAF /CUC)和 HD-ZIP（Homeodomainleucine zipper） 這些轉(zhuǎn)錄因子的家族成員對(duì)棉花纖維發(fā)育具有一定的影響。本研究中，除靶基因Gh_A05G2939 外，差異表達(dá)的 cme-miR166i_R-1_1ss18CT 的靶基因均為HD-ZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子，從轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控靶基因。Walford 等[44]發(fā)現(xiàn)HD-ZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)基因GhHD-1 在胚珠和纖維發(fā)育早期表達(dá)量較高，當(dāng)沉默該基因時(shí)纖維起始期推遲；過(guò)表達(dá)該基因時(shí)，種子表面起始的纖維數(shù)量增多。本研究中cme-miR166i、ghr-miR166b、gma-miR166a、gra-MIR166c 等屬于MiR166 家族的 miRNA 的靶基因均為 HD-ZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄因子可能參與到纖維發(fā)育過(guò)程中。mtr-miR171c_1ss19AT 和tcc-miR171d_1ss1TC 同屬于 MiR171 家族，其靶基因均為GRAS 家族轉(zhuǎn)錄因子，這也是首次在棉花胚珠中發(fā)現(xiàn)GRAS 家族轉(zhuǎn)錄因子，具體功能需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Wan 等[6]用圖位克隆方法定位到顯性光子基因N1即GhMML3_A12，該基因組位點(diǎn)的正反兩條鏈都轉(zhuǎn)錄，形成順式天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)，進(jìn)而影響短絨的形成；Wu 等[33]克隆出控制長(zhǎng)纖維發(fā)育的基因Li3即GhMML4_D12，該基因影響長(zhǎng)纖維的形成。這兩個(gè)基因都編碼MYB 類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響短絨或長(zhǎng)纖維的形成。Guan 等[41]證實(shí) miR828和miR858 的靶基因?yàn)镚hMYB2D，當(dāng)GhMYB2D與miR828 的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，可以恢復(fù)gl1 突變體的表型，說(shuō)明miR828 通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控GhMYB2D來(lái)影響葉表皮毛和纖維的發(fā)育。Wu 等[45]發(fā)現(xiàn)一個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子 Gh-Myb25 在纖維起始期特定表達(dá)，將該轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化到煙草后，煙草葉表皮毛數(shù)目相比野生型增多，并且表皮毛的分枝數(shù)量也有所增加。本研究中 ghr-miR172、gra-MIR166c、mesmiR319a、ppe-miR159、PC-3p-89741 這些 miRNA的靶基因均為MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，gma-miR828a的靶基因也為MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，與Guan 等[41]的研究結(jié)果一致。ghr-miR164、gma-miR164a、gra-MIR164a、mdm-miR164a 等 MiR164 家族的 miRNA 的靶基因大多數(shù)為 NAC 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。gma-miR164a 的其中一個(gè)靶基因Gh_D11G0347，與 Naoumkina 等[29]的研究一致，說(shuō)明 miR164 通過(guò)調(diào)控該基因來(lái)影響棉花纖維起始發(fā)育。

除上述轉(zhuǎn)錄因子外，本研究還發(fā)現(xiàn)miR156的靶標(biāo) SPL 轉(zhuǎn)錄因子、MiR171 家族的靶基因GRAS 家族轉(zhuǎn)錄因子及其他一些靶標(biāo)非特異的轉(zhuǎn)錄因子。其中發(fā)現(xiàn)ptc-miR167f 的一個(gè)靶基因Gh_D13G0769，該基因編碼FEZ 蛋白，屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，與擬南芥基因AT1G26870 同源，在擬南芥中調(diào)控根細(xì)胞分裂[46]，說(shuō)明該基因在頂端生長(zhǎng)中起著重要作用，有可能調(diào)控棉纖維細(xì)胞的分化發(fā)育。miRNA 靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控棉花纖維細(xì)胞的分化的機(jī)理還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 miRNA靶標(biāo)植物激素類(lèi)相關(guān)基因參與纖維起始發(fā)育

植物激素在細(xì)胞分裂與伸長(zhǎng)、組織與器官分化、開(kāi)花與結(jié)實(shí)、成熟與衰老、休眠與萌發(fā)以及離體組織培養(yǎng)等方面起著重要作用，對(duì)棉花纖維發(fā)育也有一定的影響。有研究表明生長(zhǎng)素（Auxin，IAA）、油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BR）、乙烯（Ethylene）和赤霉素（Gibberellin，GA）等植物激素對(duì)棉花纖維的起始和伸長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。

Zhang 等[47]用轉(zhuǎn)基因方法提高纖維起始期胚珠表皮的生長(zhǎng)素含量，與野生型相比轉(zhuǎn)基因株系的胚珠表皮纖維細(xì)胞分化增多，衣分和纖維產(chǎn)量也得到了提高。本研究中 ath-miR160a、gmamiR160a 、tcc-miR160b 、tcc-miR167c 、ghrmiR167a、gma-miR167e 等的靶基因大部分為生長(zhǎng)素響應(yīng)因子，說(shuō)明MiRNA160 家族和MiRNA167 家族通過(guò)靶向調(diào)控生長(zhǎng)素合成和代謝相關(guān)基因來(lái)調(diào)控棉花纖維細(xì)胞的發(fā)育。Yang 等[48]在TM-1 早期胚珠EST 庫(kù)中富集到一些 BR 合成（SMT1、SMT2s和BR6OX）以及信號(hào)傳導(dǎo)（BRI1s、BAK1s、BES1s、CPD） 途徑相關(guān)基因，說(shuō)明BR 在纖維起始發(fā)育中也起著一定的作用。本研究中 gma-miR159d 的兩個(gè)靶基因Gh_A01G1454、Gh_D01G1695，編碼 BR 信號(hào)激酶，可能通過(guò)調(diào)控BR 信號(hào)通路中的基因來(lái)間接影響棉花胚珠細(xì)胞的分化。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法對(duì)新鄉(xiāng)小吉的野生型及其無(wú)絨有絮突變體0 DPA 的胚珠進(jìn)行了小RNA 測(cè)序，共得到459個(gè) miRNA，包括 301個(gè)保守 miRNA和158個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA。篩選出13個(gè)差異表達(dá)的miRNA，并進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因側(cè)重于編碼 HD-ZIP、GRAS、AP2 家族的轉(zhuǎn)錄因子，功能集中在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控階段。對(duì)靶基因進(jìn)行GO 注釋發(fā)現(xiàn)，這些靶基因參與細(xì)胞分化、花藥發(fā)育、花器官發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。miRNA 通過(guò)負(fù)調(diào)控靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子和激素相關(guān)基因來(lái)影響纖維細(xì)胞的起始發(fā)育。該研究不僅為進(jìn)一步深入研究miRNA 在纖維起始過(guò)程中的作用提供了豐富的資源，也為闡明棉花纖維突起的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。