南瓜籽發(fā)芽富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件優(yōu)化

白青云，陳敏嫣，張化賢，趙立

（淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇淮安223003）

南瓜籽（Semen Moschatae）是葫蘆科草本植物南瓜的成熟種子，種類豐富，產(chǎn)量巨大。南瓜籽中含有豐富的多不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，同時富含蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量可達35%以上。南瓜籽還具有一定的保健功能，如降血脂、抗氧化、抗炎、預防前列腺炎等疾病[1]。目前南瓜籽只是作為種子或者簡單的休閑食品，附加值低。南瓜籽是一個活的有機體，在貯藏過程中不斷進行新陳代謝等一系列的生物化學變化[2]，在適宜條件下會發(fā)芽變成芽類食品。由于種子在發(fā)芽過程中會提高維生素C、異黃酮等營養(yǎng)成分含量[3,4]，芽類食品成為食品界的新寵，研究較多的有發(fā)芽糙米[5]、發(fā)芽大豆[6]、發(fā)芽粟谷[7]和發(fā)芽蠶豆[8]等。目前發(fā)芽糙米已經(jīng)達到了工業(yè)化生產(chǎn)水平[9]，而國內(nèi)外對發(fā)芽南瓜籽研究的較少，所研究內(nèi)容也僅限于發(fā)芽過程中南瓜籽生物學特性[10]和亞油酸含量變化[11]等方面。因此，開發(fā)芽類南瓜籽新產(chǎn)品，提高南瓜籽附加值，成為新的研究方向。

GABAγ-氨基丁酸是生物體內(nèi)廣泛存在的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，主要由谷氨酸（Glu）經(jīng)谷氨酸脫羧酶（GAD EC 4.1.1.15）脫羧產(chǎn)生，是哺乳動物大腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，利用谷物及果蔬中自身存在的谷氨酸脫羧酶，可富集對人體有保健作用的GABA[7,12]。GABA具有降血壓、利尿、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、改善失眠以及肝腎功能活化等作用[13]。植物組織中GABA含量很低，不能滿足人體需要，因此提高GABA含量的方法受到廣泛關注。本研究以營養(yǎng)豐富的南瓜籽為原料，采用發(fā)芽法研究南瓜籽富集GABA的工藝條件，優(yōu)化富集GABA的技術參數(shù)，為開發(fā)富含GABA的南瓜籽食品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜籽，淮安市城南農(nóng)貿(mào)市場；GABA標品，購自美國Sigma化學品公司；無水乙醇、冰醋酸、苯酚、次氯酸鈉、氯化鈣（CaCl2）、谷氨酸鈉（MSG）、維生素B6（VB6）等購自國藥化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

TDL-40B型離心機，上海安亭儀器廠；V-1000型可見分光光度計，上海翔藝儀器有限公司；101-1BS型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；FK-A組織搗碎勻漿機，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 南瓜籽發(fā)芽工藝

稱取一定量的南瓜籽，用1%次氯酸鈉溶液消毒30 min，于25℃去離子水中浸泡6 h，將種子撈出吸去明水，置于墊有四層紗布的培養(yǎng)盤中，均勻鋪開，在一定溫度的培養(yǎng)箱中用配置的培養(yǎng)液浸漬避光培養(yǎng)一定時間，培養(yǎng)結束后取出樣品，測定南瓜籽中GABA含量（鮮重）。

1.3.2 培養(yǎng)條件對南瓜籽富集GABA的影響

影響南瓜籽富集GABA的工藝主要有培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)液pH，首先做單因素實驗，設定培養(yǎng)溫度范圍為26～32℃，培養(yǎng)時間為24～84 h，緩沖液pH為4.6～7.0，在單因素實驗的基礎上，采用正交試驗的三因素三水平試驗設計，優(yōu)化南瓜籽富集GABA的最佳發(fā)芽工藝。

1.3.3 培養(yǎng)液組分對南瓜籽富集GABA的影響

為進一步提高南瓜籽中GABA含量，在最佳發(fā)芽工藝基礎上，在培養(yǎng)液中添加促進GABA富集的外源添加物MSG、VB6和CaCl2，研究各組分添加量對南瓜籽富集GABA的影響。各組分濃度范圍設定為：MSG 2～10 mg/mL、VB60.1～0.9 mmol/mL、CaCl22.0～10.0 mmol/L。對影響南瓜籽GABA富集的添加物組分采用Box-Behnken design實驗設計進行優(yōu)化，以GABA含量作為考察值，得出南瓜籽富集GABA的最優(yōu)培養(yǎng)液組分。

1.4 GABA測定方法

取發(fā)芽的南瓜籽樣品磨碎后，精確稱取1 g樣品于20 mL離心管中，再加入6 mL 7%的乙酸提取1 h后，于4 000 r/min離心10 min，上清液中再加入4 mL無水乙醇沉淀30 min，4 000 r/min離心10 min后，上清液經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮至干，用1 mL蒸餾水溶解后于10 000 r/min離心10 min，上清液用于測定GABA含量。參照白青云等[14]的方法，采用比色法測定樣品中GABA含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗設重復3次，結果以x±SD表示，采用設計專家Design expert7.0軟件和SPSS16.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)，進行方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)條件對南瓜籽中GABA含量的影響

2.1.1 培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量的影響

圖1 培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量的影響Fig.1 Effect of culture temperature on GABA content of pumpkin seed

圖1顯示了培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量的影響，由圖1可見，在26～32℃范圍內(nèi)南瓜籽用去離子水培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量有顯著影響，呈先上升后下降的趨勢，30℃時南瓜籽中GABA含量最高，為0.215 mg/g，分別比26℃和32℃提高109.18%和105.27%。由此表明，最適溫度為30℃。

2.1.2 培養(yǎng)時間對南瓜籽GABA含量的影響

在溫度30℃、培養(yǎng)液pH5.8的條件下南瓜籽中GABA含量隨培養(yǎng)時間的延長而變化的情況見圖2。從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，南瓜籽中GABA含量呈先增加后降低的趨勢，培養(yǎng)48 h含量最高，為0.217 mg/g，是剛開始培養(yǎng)（0 h）的2.94倍。因此，選擇培養(yǎng)48 h為南瓜籽富集GABA的適宜時間。

圖2 培養(yǎng)時間對南瓜籽中GABA含量的影響Fig.2 Effect of culture time on GABA content of pumpkin seed

2.1.3 培養(yǎng)液pH對南瓜籽中GABA含量的影響

在培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間48 h的條件下，培養(yǎng)液pH對南瓜籽中GABA富集的影響結果見圖3。研究表明，酸性環(huán)境下有利于植物GABA的富集[14]。由圖3可知，pH在4.6～7.0之間，GABA含量隨pH的升高先上升后下降。當pH為5.8時，GABA含量最高，分別是pH4.6和6.4時含量的2.34倍和2.57倍。因此，南瓜籽富集GABA的適合pH為5.8。

圖3 培養(yǎng)液pH對南瓜籽中GABA含量的影響Fig.3 Effect of culture solution pH on GABA content of pumpkin seed

2.1.4 正交試驗法優(yōu)化南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)工藝

在單因素實驗的基礎上，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)液pH三因素進行正交試驗，優(yōu)化南瓜籽富集GABA的最適培養(yǎng)工藝，試驗設計及結果見表1。

表1 南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)工藝正交試驗結果Table 1 The results of orthogonal test on germination process of GABA accumulation in pumpkin seed

由表1的極差分析可知，培養(yǎng)液pH是最主要的影響因素，培養(yǎng)溫度次之，最后是培養(yǎng)時間。南瓜籽富集GABA的最適培養(yǎng)工藝為A3B3C1，即培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時間60 h、培養(yǎng)液pH5.2。在最適培養(yǎng)工藝下，南瓜籽中GABA含量為0.245 mg/g，是原料的3.50倍（南瓜籽原料中GABA含量測定為0.093 mg/g干重，南瓜籽吸水后含水量測定為25.1%）。

2.2 培養(yǎng)液組分對南瓜籽富集GABA的影響

2.2.1 CaCl2濃度對南瓜籽中GABA含量的影響

由圖4可知，隨著CaCl2濃度的增加，南瓜籽GABA含量呈先上升后下降的變化趨勢。當CaCl2濃度為6mmol/L時，GABA富集量最高，為0.290 mg/g，比未添加（最適培養(yǎng)工藝）提高了18.4%。這可能是因為植物中胞質(zhì)Ca2+濃度的增加會刺激GAD活性，從而促進GABA積累[17]。

2.2.2 MSG添加量對南瓜籽GABA含量的影響

由圖5可知，隨著培養(yǎng)液中MSG添加量的增加，南瓜籽中GABA含量呈先增長后下降的趨勢。當MSG添加量為 8 mg/mL時，GABA 含量最高（0.308 mg/g），是未添加（最優(yōu)培養(yǎng)工藝下）的1.26倍?？赡苁且驗镸SG作為植物GAD的專一底物，可以促進GABA的合成[15]。白青云等[12]關于馬鈴薯的研究也表明，馬鈴薯中添加MSG可以促進GABA的富集，與本研究的結果一致。

圖4 CaCl2濃度對GABA含量的影響Fig.4 Effects of CaCl2concentration on GABA content

圖5 MSG濃度對GABA含量的影響Fig.5 Effects of MSG concentration on GABA content

2.2.3 添加VB6對南瓜籽GABA含量的影響

圖6 VB6濃度對GABA含量的影響Fig.6 Effects of VB6concentration on GABA content

培養(yǎng)液中添加VB6對南瓜籽中GABA含量的影響如圖6（見上頁）所示。GABA含量隨VB6添加量的增加先增加后顯著降低，當VB6為0.3 mmol/mL時，GABA含量達到最高。這可能是因為，VB6是GAD的輔基磷酸吡哆醛（PLP）的前體物質(zhì)，有激活GAD達到富集GABA的作用。

2.2.4 南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，選用三因素三水平的Box-Behnken試驗設計對南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分進行優(yōu)化，試驗方案和相應的實驗結果見表2。

利用Design Expert軟件，對表2數(shù)據(jù)進行二次多元逐步回歸擬合，得到馬鈴薯富集GABA預測值的二次多項逐步回歸方程：Y=-0.4978+0.2138X1+0.0723X2+0.2032X3+0.0085X1X2-0.0144X1X3+0.0400X2X3-0.0258X12-0.0086X22-0.8669X32。

對上述回歸模型進行方差分析見表3，結果表明，回歸模型的F=28.27，P=0.0001，模型顯著，其決定系數(shù)R2=0.9732，說明此模型相關性良好，模型具有實踐指導意義。

表2 南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分優(yōu)化的應面實驗Table 2 Response surface method on components of culture solution for GABA accumulation in pumpkin seed

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of Variance(ANOVA) for the regression model

由表3可見，CaCl2的一次項和二次項對南瓜籽GABA含量有極顯著的影響（P<0.01），MSG的二次項對南瓜籽GABA含量有顯著影響，VB6的一次項和二次項對南瓜籽GABA含量有顯著的影響（P<0.05），其中只有CaCl2和MSG兩者的交互作用對南瓜籽富集GABA的影響顯著（P<0.05）。

根據(jù)回歸法分析所得二次方程，在試驗設定范圍內(nèi)，得到交互作用影響顯著的兩變量之間二次回歸方程的響應曲面圖，見圖7。當VB6濃度為0.3 mmol/mL時，在固定的MSG濃度下，GABA含量隨CaCl2濃度的增加呈先逐漸增加隨后緩慢下降的趨勢。當CaCl2濃度為5.03 mmol/L時，GABA富集量最大。當MSG濃度為7.46 mg/mL，GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物，添加適量的MSG可以促進GABA合成，形成有效積累[14]。Ca2+是GAD的激活劑，通過與GAD碳末端的Ca2+/CaM調(diào)節(jié)區(qū)域結合而激活其活性[18]，促進GABA富集。研究報道，MSG與CaCl2的聯(lián)合處理可促進馬鈴薯GABA含量的提高[14]，本研究結果與此報道結果一致。

根據(jù)Box-Behnken試驗結果，南瓜籽富集GABA的最佳培養(yǎng)液組分濃度分別為CaCl25.03 mmol/L、MSG 7.46 mg/mL、VB60.28 mmol/mL，在此條件下南瓜籽富集GABA的預測值為0.357 mg/g，驗證試驗得出實測值為0.361 mg/g，說明預測值和實際值之間存在較高的擬合度，所建立的模型是可靠的，可以用來描述組分濃度與響應值之間的關系。以培養(yǎng)液組分最適濃度培養(yǎng)的南瓜籽GABA含量是對照（未添加各組分，0.245 mg/g）的1.47倍，是原料的5.18倍，說明優(yōu)化后的培養(yǎng)液組分能顯著提高南瓜籽中GABA含量。

圖7 MSG和CaCl2的交互作用對南瓜籽GABA含量影響的響應曲面圖Fig.7 Response plots for the interaction effects of MSG and CaCl2on GABA content of pumpkin seed

3 結論

采用正交試驗設計優(yōu)化了南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)液pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對南瓜籽GABA富集有顯著影響，三因素的影響順序依次為培養(yǎng)液pH＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間，最佳的發(fā)芽工藝為培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時間60 h、培養(yǎng)液pH5.2，此時南瓜籽中GABA的富集量為0.245 mg/g，是原料的3.50倍。采用響應面的Box-Benhnken法對南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分進行優(yōu)化，南瓜籽GABA富集的最佳組分為CaCl2濃度 5.03 mmol/L、MSG濃度 7.46 mg/mL和 VB6濃度0.28 mmol/mL，在此條件下南瓜籽中GABA含量為0.361 mg/g，是原料的5.18倍。方差分析可知，CaCl2和VB6的一次項、CaCl2和MSG的交互作用均顯著影響南瓜籽中GABA含量。