阿維巴坦類似物的合成及抗菌活性研究

葉海偉，周麗萍，陳云華

(臺州職業(yè)技術學院 化學制藥研究所,浙江 臺州 318000)

經典β-內酰胺抗生素的濫用易導致細菌的耐藥,使人們對抗生素產生“恐懼”心理。近年來,新型β-內酰胺酶抑制劑的復方品種呈增長趨勢,如阿維巴坦、Relebactam等新型巴坦類藥物的問世無疑給處于低谷的抗生素領域吹來一股新風[1]。

2015年2月,由阿維巴坦與頭孢他啶組成的復方產品Avycaz獲得美國FDA批準上市,用于治療成人復雜性腹腔內感染及尿路感染,與頭孢洛林、氨曲南等其他復方產品分別處于臨床Ⅱ和Ⅰ期中,是目前最被看好的非β-內酰胺類抑制劑[2-3]。阿維巴坦、Relebactam均為7-氧代-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷衍生物,兩者具有相同的母核結構,僅是側鏈酰胺鍵上取代基的不同，如圖1所示。

圖1 阿維巴坦和Relebactam的結構Fig.1 Structure of avibactam and relebactam

另外,在傳統(tǒng)的β-內酰胺類抑制劑中,他唑巴坦較舒巴坦多連接了一個三氮唑環(huán),表現(xiàn)出毒性低、穩(wěn)定性好、抑酶活性強等性質,而且與氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林等抗生素聯(lián)用均取得有效的協(xié)同作用[4]如圖2所示?？梢?三氮唑作為優(yōu)秀的連接鏈模塊被廣泛應用于連接各種功能分子片段,得到的衍生物表現(xiàn)為更強勁的藥效特點。

圖2 舒巴坦和他唑巴坦的結構Fig.2 Structure of sulbactam and tazobactam

從氫鍵供體/受體性質上講,1,2,3-三氮唑的C-4原子具有親電性,該C—H鍵上的氫具有一定的氫鍵供體性質,且N-3的孤對電子又可以扮演氫鍵受體的角色;而1,4-二取代三氮唑可作為生物電子等排體,具有酰胺鍵的類似性質[5]?；谝陨先虻慕Y構特點,查閱現(xiàn)有文獻[6-9]對阿維巴坦類似物的結構修飾主要集中在酰胺鍵上連接不同的取代基,研究其對藥物活性的影響,并無阿維巴坦母核結構與被取代的三氮唑通過亞甲基鏈接的衍生物報道。因而設計合成具有三氮唑結構的阿維巴坦類似物,并通過對銅綠假單胞菌和大腸桿菌最小抗菌濃度的測試,考察其抑菌活性大小,從而尋找活性更好的新穎巴坦類藥物結構。

結合相關文獻[4, 10-14],以(2S, 5R)-6-芐氧基-7-氧-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-2-甲酸乙酯(2)為起始原料,經過還原和碘代合成(2S, 5R)-6-芐氧基-2-碘甲基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮(4),再與取代的三氮唑進行縮合使在二氮雜二環(huán)的亞甲基上引入三氮唑基團,經鈀碳加氫脫除芐基,最后引入磺酸基,即可得到相應的類似物1,總收率為31%～43%(圖3)。本路線具有反應路線簡單,操作簡便的優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

儀器:RY-1型熔點儀(天津市分析儀器廠)、Varian-400 MHz核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑,TMS為內標,美國Varian公司)、Trace DSQ FINNIGSN質譜儀和Thermo IEC冷凍高速離心機(美國熱電公司)、DZX-40BI 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

試劑:試劑均為AR,溶劑使用前均按標準方法處理。Mueller-Hinton肉湯(北京陸橋技術有限責任公司)、硫酸慶大霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)、阿維巴坦(自制)。

1.2 實驗方法

1.2.1 (2S 5R)-6-芐氧基-2-羥甲基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮(3)的合成 取250 mL四口燒瓶,加入原料(2S,5R)-6-芐氧基-7-氧-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-2-甲酸乙酯(2, 25.0 g, 82.2 mmol),甲醇180 mL,降溫至-5～-10℃,然后分批加入硼氫化鋰(5.4 g, 246.6 mmol),并控制溫度在0℃以下繼續(xù)攪拌反應5 h后,加入飽和磷酸二氫鈉100 mL進行淬滅反應,減壓回收甲醇后,向剩余物中加入二氯甲烷進行萃取三次(80 mL×3),合并有機相,加入無水硫酸鈉干燥,過濾,濾液進行減壓濃縮后經柱層析純化(流動相為正己烷/乙酸乙酯=2∶1(體積比)),得白色固體的(2S,5R)-6-芐氧基-2-羥甲基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮(3)18.2 g,收率為84%。Mp:233℃～235℃;1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.42-7.34 (m, 5H), 5.07 (d,J=12.0 Hz, 1H), 4.96 (d,J=12.0 Hz, 1H), 3.73-3.69 (m, 1H), 3.61-3.58 (m, 2H), 3.33-3.30 (m, 1H), 3.10 (d,J=12.0 Hz, 1H), 2.91 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 2H), 1.58-1.53 (m, 1H), 1.42-1.26 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 263.1 [M+H]+。

1.2.2 (2S,5R)-6-芐氧基-2-碘甲基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮(4)的合成 在250 mL四口瓶中,加入(2S, 5R)-6-芐氧基-2-羥甲基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮(3, 7.9 g, 30.0 mmol)和二氯甲烷80mL,在冰浴下加入三苯基膦(9.4g, 36.0 mmol)、咪唑(3.1 g, 45.0 mmol)和碘(9.1 g, 36.0 mmol),攪拌下逐漸升至室溫反應3h,加入飽和亞硫酸鈉80 mL淬滅,用乙酸乙酯萃取(80 mL×3),合并有機相,無水硫酸鈉干燥,過濾,濾液進行減壓濃縮后經柱層析純化(正己烷/乙酸乙酯=5∶1(體積比)),得淺黃色油狀產物(2S,5R)-6-芐氧基-2-碘甲基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮9.7g,收率為87%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.39-7.29 (m, 5H), 5.01 (d,J=12.0 Hz, 1H), 4.91 (d,J=12.0 Hz, 1H), 3.68-3.50 (m, 3H), 3.33-3.26 (m, 1H), 3.02-2.89 (m, 2H), 2.07-1.98 (m, 2H), 1.56-1.50 (m, 1H), 1.41-1.28 (m, 1H);MS(ESI):m/z(%) 395.0 [M+Na]+。

圖3 阿維巴坦類似物的合成路線Fig.3 Route of avibactam analogues synthesis

1.2.3 阿維巴坦類似物1a的合成 在100 mL三口瓶中,加入(2S,5R)-6-芐氧基-2-碘甲基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮(4, 2.4 g)，1H-1,2,3-三氮唑(4.8 g)，碳酸氫鈉(1.0 g)，丙酮30 mL和水6 mL,室溫下攪拌反應,TLC跟蹤檢測反應,減壓蒸除丙酮,向剩余物中加入45mL乙酸乙酯進行萃取,分出有機層,用飽和氯化鈉溶液洗滌,無水硫酸鈉干燥,過濾,濾液進行減壓濃縮后得到相應的中間產物,不經純化,直接投入下一步。

在另一只100 mL三口瓶中,加入上述得到的相應中間產物(2S,5R)-2-((1H-1,2,3-三氮唑-1-)甲基)-6-芐氧基-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-7-酮、10%鈀碳0.3 g和乙醇20 mL,在氫氣氛圍下攪拌進行脫除芐基反應,反應過程采用TLC跟蹤檢測反應,反應結束后,加入硅藻土進行過濾后,濾液進行減壓濃縮得到粗品,再加入吡啶15 mL和三氧化硫吡啶絡合物(5.6 g, 35.0 mmol),室溫下攪拌進行磺化反應8h后,減壓濃縮反應液,再經柱層析純化(V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)=5∶4∶1),得到淺黃色油狀物為阿維巴坦類似物1a為1.4 g,收率53%。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ:7.75(d,J=6.0Hz, 2H), 4.00-3.88 (m,2H), 3.73-3.69 (m, 1H), 3.61-3.58 (m, 2H), 3.33-3.21 (m, 1H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 2H), 1.42-1.26 (m, 1H)。MS (ESI):m/z(%) 304.1 [M+H]+。

根據(jù)上步類似的操作,合成阿維巴坦類似物1b～1j。

1b:淡黃色油狀物,收率58%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:7.88 (s,1H), 7.83 (s, 1H), 4.05-3.93 (m, 2H), 3.73-3.69 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 2H), 3.33-3.21 (m, 1H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 2H), 1.43-1.28 (m, 1H)。MS (ESI):m/z(%) 304.0 [M+H]+。

1c:黃色油狀物,收率52%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.81 (s, 1H), 4.00-3.88 (m, 2H), 3.73-3.68 (m, 1H), 3.60-3.55 (m, 2H), 3.36-3.25 (m, 1H), 2.90-2.88 (m, 1H), 2.36 (s, 3H), 2.07-1.99 (m, 2H), 1.42-1.26 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 318.1 [M+H]+。

1d:淺黃色油狀物,收率45%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.89 (s, 1H), 4.00-3.88 (m, 2H), 3.75-3.69 (m, 1H), 3.61-3.58 (m, 2H), 3.33-3.21 (m, 1H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.13-2.05 (m, 2H), 1.41-1.28 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 318.3 [M+H]+。

1e:黃色黏狀物,收率59%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.21 (s, 1H), 4.10-3.95 (m, 2H), 3.75-3.69 (m, 1H), 3.61-3.58 (m, 2H), 3.35-3.27 (m, 1H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.25-2.19 (m, 1H), 1.77-1.70 (m,1H), 1.4-1.26(m, 1H); MS(ESI):m/z(%) 338.1 [M+H]+。

1f:黃色油狀物,收率48%。1H-NMR (400MHz, CDCl3)δ: 8.18 (s, 1H), 4.15-3.98 (m, 2H), 3.75-3.67 (m, 1H), 3.61-3.58 (m, 2H), 3.35-3.27 (m, 1H), 2.91-2.85 (m, 1H), 2.26-2.19 (m, 1H), 1.78-1.70 (m, 1H), 1.41-1.32 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 381.9 [M+H]+。

1g:米黃色油狀物,收率45%。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ: 4.18-4.09 (m,2H), 4.01-3.95 (m, 1H), 3.75-3.68 (m, 1H), 3.63-3.58 (m, 2H), 3.36-3.29 (m, 1H), 2.29-2.22 (m, 1H), 1.78-1.70 (m, 1H), 1.43-1.34 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 459.9 [M+H]+。

1h:黃色油狀物,收率49%。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ: 8.13 (s, 1H), 4.00-3.89 (m, 2H), 3.71-3.65 (m, 1H), 3.60-3.53 (m, 2H), 3.36-3.25 (m, 1H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.07-1.99 (m, 2H), 1.38-1.25 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 349.1 [M+H]+。

1i:黃色油狀物,收率45%。1H-NMR (400MHz, CDCl3)δ: 7.41 (s, 1H), 4.09-3.98 (m, 1H), 3.90-3.81 (m, 1H), 3.73-3.68 (m, 1H), 3.65-3.56 (m, 2H), 3.36-3.25 (m, 1H), 2.93-2.89 (m, 1H), 2.07-2.00 (m, 2H), 1.38-1.25 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 372.2 [M+H]+。

1j:淡黃色油狀物,收率43%。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ: 7.93 (s, 1H), 4.15-4.08 (m, 2H), 3.78-3.69 (m, 1H), 3.63-3.57 (m, 2H), 3.33-3.21 (m, 1H), 2.77-2.64 (m, 1H), 2.13-2.07 (m, 2H), 1.41-1.29 (m, 1H); MS (ESI):m/z(%) 372.1 [M+H]+。

1.2.4 抗菌活性實驗 參照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)最小抑菌濃度(MIC)的測定方法[15],以阿維巴坦(avibactam)和硫酸慶大霉素(gentamicin sulfate)為陽性對照,測試了目標化合物對銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa, P. a)和大腸桿菌(escherichia coli, E. c.)進行體外抗菌性能的測試。

具體采用常規(guī)的測試方法如下:

1)用接種環(huán)挑取菌落3～5個,接種于4～5mL的M肉湯中,35℃孵育2～6h,增菌后的對數(shù)生長期菌液用MH肉湯校正濃度,約含1×108～2×108CFU/mL。

2)取無菌96孔板,B～H孔各加MH肉湯培養(yǎng)基99μL;A孔加MH肉湯培養(yǎng)基199μL和最適稀釋度的受試化合物溶液1μL。B～H孔分別加入最適稀釋度倍比稀釋的濃度梯度藥物各1μL,最后每孔加測試細菌100 μL,各孔中DMSO含量均不超過0.5%(體積分數(shù));陽性藥物按一定濃度梯度進行稀釋后每孔加100μL再加測試細菌100μL。各藥敏板于35℃培養(yǎng)。

3)將接種好的藥敏板,置35℃普通空氣孵箱中孵育16～20 h,用肉眼觀察每孔的渾濁度。以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。

2 實驗結果和討論

2.1 合成的優(yōu)化

以阿維巴坦關鍵中間體(2S, 5R)-6-芐氧基-7-氧-1,6-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷-2-甲酸乙酯(2)為起始原料,在醇體系下,經硼氫化鋰還原,即得化合物3,收率為84%。羥基的碘代考慮底物7-氧代-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷的結構,反應條件太苛刻容易氧化變質,選擇較為溫和的三苯基膦/咪唑/碘體系,合成中間體4,收率為87%。

接著,借助碘原子的易離去性,4與取代的三氮唑進行縮合反應使在二氮雜二環(huán)的亞甲基上引入三氮唑基團,經鈀碳加氫脫除芐基,按文獻方法[13]引入磺酸基,即可得到相應的類似物1,收率為31%～43%不等。以銅綠假單胞菌和大腸桿菌為測試對象,對相應化合物進行抗菌活性的檢測。

2.2 目標化合物的活性研究

由表1可知通過對7-氧代-二氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷的結構進行研究發(fā)現(xiàn),采用三氮唑或取代的三氮唑代替阿維巴坦結構相應位置上的酰胺鍵,并通過亞甲基進行鍵合來進行修飾,通過對銅綠假單胞菌和大腸桿菌進行體外抗菌性能的測試來篩選相應的衍生物活性,發(fā)現(xiàn)三氮唑有吸電子基團(-Br，-NO2或-CF3)取代,達到較好的的抗菌活性(類似物1g～1j),類似物1i的抗菌活性甚至要遠好于阿維巴坦。這部分化合物我們將做進一步的藥理、毒理等相關研究,具有良好的應用前景。

表1 化合物對相應細菌的抑制作用(MIC μg/mL)Tab.1 In vitro antimicrobial activities for target compounds expressed as MIC(μg/mL)

3 結 論

以阿維巴坦為先導化合物,對酰胺鍵及相關結構進行三氮唑的取代修飾,合成衍生物,通過相關的抗菌活性實驗表明對革蘭氏陽性菌(銅綠假單胞菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)具有良好的抗菌活性,對開發(fā)新型的巴坦類藥物具有重要的意義,其他位置上的結構修飾和構效關系正在進一步研究中。