β-葡聚糖對黃沙鱉生長性能、免疫及抗氧化指標的影響

梁志凌，馬艷平，馮國清，郝 樂，馬江耀，柯 浩，劉振興

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640）

【研究意義】β-葡聚糖（β-glucan）有多種生物學活性，具有免疫調(diào)節(jié)和潛在的免疫治療、抗氧化、抗感染、促進益生菌增殖、降低血脂等作用［1-2］。β-葡聚糖可以從海藻、小麥、燕麥、產(chǎn)堿桿菌、酵母等多種天然來源的植物和微生物中獲得［3］。植物來源的β-葡聚糖主要由葡萄糖以1, 3糖苷鍵和1, 4糖苷鍵連接構(gòu)成，而微生物來源的β-葡聚糖通常以1,3糖苷鍵連接構(gòu)成。作為一種新型、綠色的天然免疫增強劑，β-葡聚糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，其飼料添加劑相關(guān)功能在家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中越來越受到重視［4］。飼料中適量添加β-葡聚糖對魚類和多種水生動物的生長發(fā)育、免疫功能以及抗氧化水平都有促進作用［5-7］。

【前人研究進展】大量研究表明，在餌料中添加β-葡聚糖可以調(diào)節(jié)水生動物的非特異性免疫和抗氧化水平［8-11］。β-葡聚糖在促進魚類、蝦類生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率上有一定作用。但也有部分研究表明，β-葡聚糖對魚類的促生長作用不太明顯，可能與劑量和效應(yīng)時間有關(guān)，這有待作進一步研究［12-13］。作為免疫刺激劑的β-葡聚糖，其分子結(jié)構(gòu)、劑量和添加方式對水生動物和其他動物的免疫反應(yīng)有重要影響［14］。以往β-葡聚糖對水生動物免疫功能影響的研究，大多數(shù)針對魚類和蝦類進行，有部分則針對中華鱉（Pelodiscus sinensis）進行［15-24］，而對地方種黃沙鱉（Truogx sinensis）免疫和抗氧化功能影響的相關(guān)研究鮮見有報道?！颈狙芯壳腥朦c】黃沙鱉是中華鱉的地方種，原產(chǎn)于廣西境內(nèi)的左江、右江、郁江、邕江、西江流域，現(xiàn)分布于廣西、廣東的西江流域地區(qū)，是西江水系特有的鱉種，是經(jīng)濟價值較高的優(yōu)質(zhì)淡水水產(chǎn)品之一。綠色生態(tài)養(yǎng)殖模式是當前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中十分重要的養(yǎng)殖模式之一，對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展和為人們提供更優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)品發(fā)揮越來越重要的作用［16］。綠色生態(tài)養(yǎng)殖模式的目標是實現(xiàn)水產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中達到“無抗”“無激素”，不用藥或者少用藥，因此，制定科學合理防控水產(chǎn)品病害的綜合措施尤為關(guān)鍵。優(yōu)化基礎(chǔ)餌料、使用綠色免疫增強劑是綜合防控病害的常用手段。選擇安全有效的免疫增強劑符合綠色生態(tài)養(yǎng)殖要求和特點。

【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗在黃沙鱉的基礎(chǔ)飼料中添加β-葡聚糖，研究β-葡聚糖在綠色生態(tài)養(yǎng)殖條件下對黃沙鱉生長性能和溶菌酶（LZM）活性、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）含量等免疫指標，過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（T-SOD）活性及丙二醛（MDA）含量等抗氧化指標的影響，以期為β-葡聚糖應(yīng)用于黃沙鱉綠色生態(tài)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試黃沙鱉幼鱉和養(yǎng)殖條件 試驗于2018年6—10月在廣東省肇慶市某黃沙鱉綠色生態(tài)養(yǎng)殖場的室外飼養(yǎng)池中進行。供試黃沙鱉幼鱉平均體質(zhì)量200（±10）g，飼養(yǎng)期間飼養(yǎng)池水溫為25（±5）℃，池水中溶氧保持在3 mg/L 以上，氨氮濃度保持在0.02 mg/L以下，光照為室外自然光照條件?；A(chǔ)飼料以貝、螺、小魚、小蝦等鮮活餌料為主，占總投餌量的70%，再配30%佛山市順德區(qū)?；蕦崢I(yè)有限公司生產(chǎn)的803系列成鱉用飼料，投喂量約為鱉體質(zhì)量的2%，每天9:00和18:00各投喂1次。由于幼鱉外觀上難以區(qū)分雌雄，因此，本試驗不區(qū)分試驗動物的性別。

1.1.2 供試β-葡聚糖 供試β-葡聚糖免疫增強劑為廣東省某公司生產(chǎn)的免疫多糖(酵母細胞壁)，該產(chǎn)品主成分為β-葡聚糖（≥20.0%）。

1.2 試驗方法

選取9個條件相同的飼養(yǎng)池（10 m2長方形飼養(yǎng)池，2 m×5 m）作為試驗池，將180只健康的黃沙鱉幼鱉隨機分成3組，每組3次重復(fù)，每個重復(fù)20只，分別投喂基礎(chǔ)飼料（對照）和添加200、1 000 mg/kgβ-葡聚糖的試驗飼料，對照組所用飼料中除沒有添加β-葡聚糖之外，其他營養(yǎng)成分均沒有改變。每天喂食前 4 h配制餌料，添加β-葡聚糖后餌料存放在陰涼處。連續(xù)投喂120 d。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生產(chǎn)性能指標 飼養(yǎng)120 d后空腹24 h，清池點數(shù)黃沙鱉，逐只稱重，分別計算增重量、體重與內(nèi)臟比和內(nèi)臟與肝臟比。

1.3.2 免疫和抗氧化指標 連續(xù)投喂120 d后2 d，從每個重復(fù)中選3只體重相近的鱉，空腹活體采血（于頸靜脈處），將每只鱉的血液分為2份，其中1份以肝素抗凝制備抗凝血供測定CAT活力；1份于室溫下傾斜自然凝固后以3 000 r/min 離心15 min，取血清分裝于1.5 mL EP管中，-80 ℃保存，用以測定LZM、T-SOD活力和ACP、AKP、MDA含量，取血后48 h內(nèi)完成檢測。檢測所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，各試驗步驟按照試劑盒說明書進行。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性檢驗采用獨立樣本t 檢驗和單因子方差分析（Oneway ANOVA, LSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡聚糖對黃沙鱉幼鱉生長性能的影響

由表1可知，試驗期間對照和β-葡聚糖200 mg/kg、1 000 mg/kg處理的黃沙鱉幼鱉增重量、體重與內(nèi)臟比和內(nèi)臟與肝臟比均無顯著差異。此外，肉眼觀察各處理黃沙鱉幼鱉的體形、內(nèi)臟形態(tài)與顏色均未出現(xiàn)明顯差別，表明本試驗添加200、1000 mg/kg兩種劑量的β-葡聚糖對黃沙鱉幼鱉的機體生長和各組織器官的正常生理機能沒有明顯不良影響。

表1 各處理黃沙鱉幼鱉增重量與體指測量結(jié)果Table 1 Tested result of the increased weight and morphological indexes of three groups of Truogx sinensis

2.2 β-葡聚糖對黃沙鱉幼鱉部分免疫和抗氧化指標的影響

由表2可知，LZM活性最高的是β-葡聚糖1 000 mg/kg處理的黃沙鱉幼鱉；β-葡聚糖1 000 mg/kg處理與對照之間、β-葡聚糖1 000 mg/kg處理組與200 mg/kg處理之間均存在顯著差異。AKP、ACP含量β-葡聚糖處理均高于對照，但差異不顯著。T-SOD活性β-葡聚糖處理高于對照，而且β-葡聚糖200 mg處理和對照之間差異顯著。CAT活力和MDA含量各處理之間均沒有顯著差異。

3 討論

餌料是影響魚類消化道菌群的因素之一，魚類攝食不同餌料對腸道菌群有一定影響［17］。在魚類生長發(fā)育早期，腸道經(jīng)歷了不同菌群的定植與演替，消化道、免疫系統(tǒng)的發(fā)育尚未完善，特別是腸道微生態(tài)平衡很容易受到干擾，可通過餌料中添加適量免疫增強劑優(yōu)化餌料的品質(zhì)，從而調(diào)節(jié)魚類的免疫水平［18］。目前已有研究證實, β-葡聚糖可以通過激活魚體內(nèi)的非特異性免疫反應(yīng)以及體液防御系統(tǒng)來增強魚體的抗感染能力，β-葡聚糖對魚類非特異性免疫機能的影響表現(xiàn)在可提高魚類血清中相關(guān)酶的活性，如LZM、ACP和KP；提高魚類體內(nèi)吞噬細胞活性，提高細胞因子水平等［19］。黃沙鱉生長早期可能與魚類生長發(fā)育早期的情況相似，因此β-葡聚糖顯示出提高幼鱉非特異性免疫水平的作用。

溶菌酶是動物自身的非特異性免疫因子，是動物機體體液免疫的主要參與者，參與多重免疫反應(yīng)機制，在抵抗外來病原菌入侵中發(fā)揮重要作用［20］。動物體內(nèi)許多組織和體液中都含有溶菌酶, 抗原性物質(zhì)或者免疫刺激劑可以使血清中的溶菌酶活力上升［21］。堿性磷酸酶普遍存在于動物體內(nèi)，在堿性條件下可使磷酸單脂水解生成乙醇和磷酸，與某些營養(yǎng)物質(zhì)的消化有關(guān)。酸性磷酸酶是巨噬細胞溶酶體的標志酶，巨噬細胞吞噬異物時，與異物顆粒形成吞噬體后用包括酸性磷酸酶在內(nèi)的溶解酶消化異物顆粒，因此酸性磷酸酶的活性代表吞噬細胞清除異物的能力，也就是非特異性免疫能力。堿性磷酸酶和酸性磷酸酶均參與動物體內(nèi)的免疫活動［22］，這兩種酶和溶菌酶都是重要的非特異性免疫酶，在水生動物體液免疫和抗病過程中起重要作用。這些酶活力的高低也常被用作評價水生動物免疫機能狀態(tài)的重要指標，這3種酶的活性可以反映黃沙鱉非特異性體液免疫狀態(tài)，在一定程度上反映黃沙鱉非特異性免疫功能的高低［23］。本研究結(jié)果表明，在基礎(chǔ)餌料中添加β-葡聚糖1 000 mg/kg可以顯著提高黃沙鱉幼鱉血清溶菌酶活性，這與汪成竹等［24］研究免疫多糖（酵母細胞壁）對中華鱉非特異性免疫功能影響的結(jié)果基本一致。堿性磷酸酶含量β-葡聚糖處理組顯著升高，表明基礎(chǔ)餌料添加β-葡聚糖有助于提高黃沙鱉幼鱉的非特異性免疫水平；酸性磷酸酶含量β-葡聚糖處理組均高于對照組，但沒有表現(xiàn)出顯著差異，其原因有待進一步研究。

表2 各處理黃沙鱉幼鱉非特異性免疫指標和抗氧化水平測定結(jié)果Table 2 Tested result of non-specific immunity index and antioxidant level of three groups of Truogx sinensis

動物機體是通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基的，這種自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物如醛基、酮基、羰基、羥基、氫過氧基以及新的氧自由基等。氧自由基通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化作用引起細胞損傷，還通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷。T-SOD和CAT是動物非特異性免疫系統(tǒng)中主要的免疫抗氧化酶，對機體的氧化與抗氧化平衡具有至關(guān)重要的作用，能清除超氧陰離子自由基（O2-·），保護細胞免受損傷。因此，測定CAT 、T-SOD活力和MDA含量可以分析機體的抗氧化水平。MDA的測定常常與T-SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究顯示，添加β-葡聚糖能提高T-SOD活力，而添加β-葡聚糖并沒有改變MDA含量，表明基礎(chǔ)餌料添加β-葡聚糖也有助于加強黃沙鱉幼鱉機體的抗氧化能力。

4 結(jié)論

綠色生態(tài)養(yǎng)殖環(huán)境下在基礎(chǔ)餌料基礎(chǔ)上添加1 000 mg/kgβ-葡聚糖有助于增強黃沙鱉幼鱉的非特異性免疫功能，而且不影響黃沙鱉的生長和體型。1 000 mg/kg 的添加量可以作為下一步優(yōu)化β-葡聚糖添加量的參考值。在綠色生態(tài)養(yǎng)殖環(huán)境下使用適量β-葡聚糖添加劑來提高黃沙鱉的免疫水平是可行的。