非洲菊CAD基因的密碼子偏好性分析

王星淇，石小保，林芳柯，孫雪麗，劉范，田娜，郝向陽，程春振

（福建農(nóng)林大學園藝學院，福建福州 350002）

遺傳轉(zhuǎn)化是研究基因功能和植物遺傳改良的重要手段。在特定植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系不夠成熟或研究一個植物的基因在其他植物或微生物中的作用時，常常會用到異源表達系統(tǒng)。然而不同生物對密碼子的使用有一定的偏好性，這使得在異源表達某一基因時有時會出現(xiàn)基因在異源表達系統(tǒng)中不能成功翻譯出相應蛋白的情況。因此，在進行基因克隆、基因功能鑒定、異源表達系統(tǒng)選擇以及改進和優(yōu)化提高基因表達水平等方面的研究時，密碼子偏好性分析顯得極為重要[1]。

非洲菊是世界五大鮮切花之一[2]，具有極高的經(jīng)濟價值。然而非洲菊抗逆性較弱，容易受病害和環(huán)境變化的影響[3]，提高非洲菊的抗逆性對非洲菊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展意義重大。木質(zhì)素生物合成途徑在植物抗逆反應中發(fā)揮著重要作用[4]。肉桂醇脫氫酶（C A D）是木質(zhì)素生物合成途徑最早被研究的酶之一，其在木質(zhì)素單體生物合成的最后一步反應過程中催化肉桂醛還原成相應的木質(zhì)素單體的前體[5-6]，在3種木質(zhì)素的合成過程中都起到了非常重要的作用。CAD基因自1973年被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外學者從其組成結(jié)構(gòu)、生物性質(zhì)、基因克隆及遺傳轉(zhuǎn)化等方面展開了系列研究，并取得了一定的進展。目前有關(guān)非洲菊CAD基因的研究較少，該研究基于前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了CAD基因篩選，并進行了密碼子偏好性分析，旨在為今后該基因的功能研究、生物信息學分析和木質(zhì)素代謝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CAD基因的篩選及模式生物基因組的密碼子偏好性數(shù)據(jù)來源

基于實驗室前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選包含全長CDS的CAD基因。5個常見模式生物：擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana sylvestris）、番茄（Solanum lycopersicum）、大腸桿菌（Escherichia coli）以及酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）基因組密碼子偏好性數(shù)據(jù)下載自Codon Usage Database（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）[7]。

1.2 CAD基因密碼子使用偏好性分析與堿基組成分析方法

通過CodonW軟件計算非洲菊CAD基因的ENC和CAI值，并通過使用EMBOSS在線網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/） 分析計算得到非洲菊CAD基因密碼子第1、2、3位的GC含量（GC1s、GC2s、GC3s）與總GC含量。再使用CodonW軟件獲得非洲菊CAD基因的RSCU值。

利用軟件Origin8.0進行中性繪圖分析、ENC-plot分析和 PR2分析（PR2-bias plot analysis），具體步驟參照屈蒙蒙等的方法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1CAD基因家族的ENC和GC

從非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得5條具有完整CDS的CAD基因，分別命名為CAD1、CAD2、CAD3、CAD4、CAD5。通過CodonW軟件計算它們的ENC和CAI值，利用EMBOSS在線分析得它們的總GC含量以及位于密碼子不同位置的GC含量，整理得表1。由表1可以看出，5個非洲菊CAD基因的ENC值相差不大，介于53.37～58.07，平均值為55.77，說明非洲菊CAD基因密碼子的使用偏好性較弱。從CAI指數(shù)看，非洲菊CAD基因CAI值介于0.191～0.225，平均值為0.210，遠小于1，進一步說明了非洲菊CAD基因的密碼子偏好性較弱?？侴C含量為44.16%～50.23%，平均值為46.46%；GC1s為48.46%～55.71%，平均值為52.56%；GC2s為37.05%～40.67%，平均值為39.16%；GC3s為44.08%～57.94%，平均值為47.67%，由此推測非洲菊CAD基因家族編碼氨基酸時使用較多的A或T，G或者C的偏好性較弱，且偏向于以A或T結(jié)尾。

2.2 同義密碼子相對使用度

通過CodonW軟件分析后得到5個非洲菊CAD基因的RSCU值，取平均值后整理得到表2。偏好性較強的密碼子（RSCU＞1）有32個，其中以G或者C結(jié)尾的密碼子有12個，以A或者U（T）結(jié)尾的密碼子有20個，說明以A或者U（T）結(jié)尾的密碼子出現(xiàn)的頻率較高而G或者C的偏好性較弱，與GC含量值預測結(jié)果一致。此外，無相對使用度極大的特定同義密碼子，表明該家族成員對密碼子的偏好性較為平均，無特別偏好的密碼子。

表2 非洲菊CAD基因同義密碼子的使用頻率

2.3 CAD基因成員堿基組成

采用 SPSS17.0 進行GC1s、GC2s、GC3s、GC和ENC兩兩Pearson關(guān)聯(lián)分析，由表3可得GC1s、GC2s、GC3s、GC和ENC之間無顯著相關(guān)性（P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著），說明非洲菊CAD基因第1、2和3位上的堿基組成無特別的相似關(guān)系。

表3 非洲菊CAD基因不同位置的密碼子GC含量及ENC的相關(guān)性

圖1 5個非洲菊CAD基因的密碼子使用偏好性中性繪圖

由圖1可得，5個非洲菊CAD基因較為分散，且分布在對角線兩側(cè)，大部分都距離對角線較為接近。G1s、G2s與G3s無明顯的線性關(guān)系，與Pearson分析結(jié)果一致。

由圖2分析可得，5個非洲菊CAD基因的ENC值距離ENC的期望曲線都較遠，無顯著規(guī)律。而由圖3分析可得，這5個非洲菊CAD基因A3/（A3+T3）與G3/（G3+C3）的比值大部分與0.5偏離較大，這表明該基因編碼氨基酸時除受突變壓力的影響外，外界因素與自然壓力影響較大。且從圖3的整體布局上看，縱坐標主要集中于小于0.5的位置，橫坐標也主要集中在小于0.5的位置，這說明密碼子第3位上T（U）的含量大于A的含量，第3位上C的含量大于G的含量。

2.4 CAD基因受體系統(tǒng)選擇

目前，國內(nèi)外對非洲菊遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究仍較為少見[9-10]，非洲菊的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究也較為不成熟[11-13]，因此找尋非洲菊合適的異源表達系統(tǒng)和模式受體為基因進行相關(guān)的功能驗證以及為遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究奠定基礎(chǔ)仍然非常重要。非洲菊CAD基因家族成員密碼子平均使用頻率分別與模式植物擬南芥（At）、煙草（Nt）、番茄（Sl）、大腸桿菌（Ec）、酵母菌（Sc）基因組密碼子使用偏性的數(shù)據(jù)比較的匯總表如表4所示，與大腸桿菌使用偏性相差較大的密碼子有18個，而與酵母菌使用偏性相差較大的密碼子僅有10個，說明酵母菌真核表達系統(tǒng)較適合成為非洲菊CAD的異源表達系統(tǒng)；番茄、煙草、擬南芥與非洲菊CAD基因使用頻率相差較大的密碼子分別是10、7、6，由此推測擬南芥是作為非洲菊CAD基因遺傳轉(zhuǎn)化研究的更為理想的受體。

圖3 5個非洲菊CAD基因的PR2分析

表4 非洲菊CAD基因與5個常見模式生物基因組密碼子使用頻率的比較

3 討論

通過對5個非洲菊CAD基因的ENC和CAI值和總GC含量以及位于密碼子不同位置的GC含量的分析可得，非洲菊CAD基因的密碼子偏好性較弱，基因表達水平總體偏低。該基因編碼氨基酸時使用較多的A或T，G或者C的偏好性較弱，且偏向于以A或T結(jié)尾。同時，通過RSCU分析發(fā)現(xiàn)，非洲菊CAD基因密碼子使用偏性較強的密碼子有32個，其中以G或者C結(jié)尾的密碼子有12個，以A或者U（T）結(jié)尾的密碼子有20個。以上結(jié)果與雙子葉植物更偏好使用A或T（U）結(jié)論一致[14]。

非洲菊CAD基因位于第1、2、3位的密碼子無明顯的線性關(guān)系，A3/（A3+T3）與G3/（G3+C3）的比值大部分與中間值0.5偏離較大，可推測該基因編碼氨基酸時除受突變壓力的影響外，外界因素與自然壓力影響較大。

目前，非洲菊基因原核表達多使用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)[15-17]，而該研究發(fā)現(xiàn)酵母菌真核表達系統(tǒng)更適合作為非洲菊CAD基因的異源表達系統(tǒng)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)擬南芥是非洲菊CAD基因異源植物表達最為理想的植物受體，該結(jié)論可對非洲菊CAD基因遺傳轉(zhuǎn)化研究以及功能驗證提供參考。