中國木薯白點病發(fā)生調(diào)查及病原生物學(xué)特性研究

蔡吉苗 時濤 李超萍 王國芬 陸翠梅 黃貴修

摘 ?要??2007—2018年，本課題組在對中國木薯主栽區(qū)的病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了一種國內(nèi)尚未記載的葉斑病。病害主要危害葉片，形成圓形或不規(guī)則形、常密集分布的白色至黃褐色的病斑，故命名為白點病。該病在云南、海南、廣西等地區(qū)均有發(fā)生，絕大多數(shù)主栽品種和部分新育成種質(zhì)均受害。經(jīng)病菌分離和回接實驗以及病菌形態(tài)觀察、核糖體基因間隔區(qū)和β-微管蛋白基因序列分析，將該病病原鑒定為鏈格孢（Alternaria alternata）。病菌離體培養(yǎng)實驗表明，菌絲生長最適條件為V9、OA、CA或CMA培養(yǎng)基，28?℃，D-麥芽糖、D-山梨醇或D-乳糖，硝酸鈉，光暗交替，pH 8。分生孢子萌發(fā)最適溫度為28?℃，而致死溫度為60?℃處理5?min。殺菌劑敏感性測定結(jié)果表明，在所測試的10種藥劑中，10%苯醚甲環(huán)唑WG和25%吡唑醚菌酯WG的EC₅₀值分別為0.12、0.47?mg/L，對菌絲生長抑制率最高。

關(guān)鍵詞 ?木薯白點病;鏈格孢;生物學(xué)特性;殺菌劑中圖分類號??S435.33??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

Survey， Pathogen Identification of a White Spot Disease on Cassava and Its Biological Characteristics in China

CAI Jimiao， SHI Tao， LI Chaoping， WANG Guofen， LU Cuimei， HUANG Guixiu^*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural?Affairs?/ Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?During cassava disease survey from 2007 to 2018， one new leaf spot disease was found in the main cassava planting areas of China. The pathogen mainly infected the cassava leaves with densely formed round or irregular， white to tawny lesions. The disease was widely happened in Yunnan， Hainan， Guangxi and some other provinces， and most of the main cassava planting varieties and part of late breeding germplasms were also infected. The results of pathogen isolation， pathogenicity test， strain morphology observation， sequences analysis of Internal Transcribed Spacer and beta-Tubulin gene showed the disease was caused byAlternaria alternata. The pathogen in vitro cultured showed V9， OA， CA or CMA medium， 28?℃， D-maltose， D-sorbitol or D-lactose， NaNO₃， alternative light and pH?8 were the optimum conditions for mycelial growth. The optimum temperature for conidia germination was 28?℃?and the lethal temperature for conidia was 60?℃?remained for 5 min. Sensitivity test confirmed 10% difenoconazole WG and 25% pyraclostrobin WG had the best mycelium inhibition effect from 10 fungicides， and the EC₅₀value was 0.12 mg/L and 0.47 mg/L， respectively.

Keywords ?cassava white spot disease;Alternaria alternata; biological characteristics; fungicides

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.019

木薯（Manihot esculentacrantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬灌木狀多年生作物，起源于熱帶美洲地區(qū)，有4000多年的栽培史。1820年前后，木薯首次從東南亞傳入中國廣東，目前種植范圍已遍及華南地區(qū)，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)重要的組成部分。廣西、海南、廣東、云南、江西等地區(qū)為中國木薯主栽區(qū)，山東^[1]、河北、河南、北京、新疆^[2]等地的小范圍試種也取得了成功。木薯在我國主要用作工業(yè)原料，可生產(chǎn)變性淀粉、化工產(chǎn)品、淀粉糖等大量產(chǎn)品^[3]。據(jù)農(nóng)業(yè)部發(fā)展南亞熱帶作物辦公室統(tǒng)計，2015年中國木薯種植面積約34.87萬hm²， 干薯總產(chǎn)量271.42萬t^[4]。中國的木薯生產(chǎn)不能自給，自2005年起一直是世界上最大的進(jìn)口國^[5]。2016年，中國進(jìn)口木薯干片和木薯淀粉分別達(dá)到770.43和207.31萬t，占世界木薯干片和木薯淀粉進(jìn)口總量的60.47%和52.03%。國內(nèi)木薯種植業(yè)對保障相關(guān)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

前期研究表明，目前危害我國木薯的葉部病害主要有細(xì)菌性萎蔫病、褐斑病、炭疽病^[6]、棒孢霉葉斑病^[7]、離蠕孢葉斑病^[8]和藻斑病^[9]。這些病害均有其典型癥狀，細(xì)菌性萎蔫病為角型病斑，褐斑病為黃褐色病斑，炭疽病發(fā)生后病葉常扭曲、干枯，棒孢霉葉斑病為中央略呈白色紙質(zhì)狀、邊緣黑褐色而且周圍有明顯黃色暈圈的圓形病斑，離蠕孢葉斑病為中央有同心輪紋、邊緣深褐黃色的圓形或近圓形病斑，而藻斑病為近圓形、中央灰白色毛氈狀病斑且僅在生長末期發(fā)生。2007年以來，本課題組在對中國木薯病害的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)了一種和國內(nèi)已報道葉部病害不同的葉斑病。病原菌主要危害葉片，侵染后形成圓形或不規(guī)則形、白色至黃褐色、常密集分布的病斑，其癥狀與國外記載的white leaf spot相似^[10]，因此命名為白點病。目前該病在中國木薯主栽區(qū)普遍發(fā)生，部分地點嚴(yán)重為害，是生產(chǎn)中值得關(guān)注的一個新問題。目前國外對white leaf spot僅有發(fā)生記載，其病原鑒定、防治關(guān)鍵技術(shù)等均為空白，因此本課題組開展了該病害的發(fā)生調(diào)查、病原鑒定、病原生物學(xué)特性及防治藥劑篩選等方面研究，為相關(guān)防控工作的進(jìn)一步開展提供基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1??木薯品種和白點病病樣??木薯品種華南10號由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種與資源研究所提供。木薯白點病病樣采自海南省海口市演豐鎮(zhèn)發(fā)病的華南10號木薯發(fā)病葉片。

1.1.2??培養(yǎng)基和試劑??菌株培養(yǎng)選用V9、Czapek、PDA、CMA、CA、PSA、OA、EMA、LB等培養(yǎng)基，配方參見《植病研究方法》^[11]。DNA片段膠回收試劑盒和pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP和大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司;引物對ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TC?CTCCGCTTATTGATATGC-3′^[12]，Tub2-u：5′-GA?GAAAATGCGTGAGATTGT-3′?和Tub2-d：5′-TG?GTCAACCAGCTCAGCACC-3′^[13]由北京六合華大基因科技股份有限公司合成;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 ?殺菌劑??共10種，其中可濕性粉劑（WP）共6種，水分散粒劑（WG）3種，水劑（AS）1種，其種類、濃度等見表1。

1.2方法

1.2.1 ?木薯白點病發(fā)生調(diào)查??參考李超萍等^[6]的方法，于2007—2018年對中國木薯主要種植區(qū)進(jìn)行調(diào)查。采取5點取樣法，每個點選擇30株植株，觀察植株上的葉片發(fā)病情況，計算株發(fā)病率。

1.2.2??木薯白點病病原分離??田間采集植株典型病葉，參照文獻(xiàn)[11]的方法分離和純化病原菌。

采用孢子液噴霧法進(jìn)行病原菌致病性測定。選擇地勢平坦、土質(zhì)疏松、土壤肥力中等的田塊，采用常規(guī)方法種植木薯5個月。將病原菌在PDA平板上28?℃光照培養(yǎng)7 d后，用滅菌棉簽將菌落表面孢子洗下，用滅菌的3層擦鏡紙濾去菌絲，將分生孢子調(diào)至1×10⁴個/mL。田間選取完全展開、健康完好的木薯葉片，進(jìn)行噴霧接種，以無菌水為對照。葉片接種后用保鮮袋進(jìn)行保濕處理，48 h后去掉保鮮袋，每7 d觀察一次，待病害發(fā)生后，觀察其癥狀并從發(fā)病部位重新分離病原菌，觀察菌落特征以及分生孢子形狀，與最初分離且接種發(fā)病的菌株做對比，確認(rèn)分離物的致病性。

1.2.3 ?木薯白點病病原鑒定、生物學(xué)特性研究和殺菌劑篩選??參照時濤等^[14]方法進(jìn)行病原菌落形態(tài)、分生孢子等結(jié)構(gòu)的觀察和測量、ITS序列分析、生物學(xué)特性以及殺菌劑配制、室內(nèi)毒力測定等方面研究。生物學(xué)特性測定中，各處理5個平板，重復(fù)3次，計算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并用SAS?9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析^[15]。

2結(jié)果與分析

2.1木薯白點病的發(fā)生調(diào)查

經(jīng)過多年度多次調(diào)查，發(fā)現(xiàn)木薯白點病在海南省儋州市、?？谑?、文昌市、白沙縣和瓊中縣，廣西壯族自治區(qū)北海市、南寧市、桂平市、平南縣，廣東省遂溪縣、雷州市，云南省保山市，江西省撫州市，福建省大田縣以及貴州省望謨縣等地區(qū)普遍發(fā)生，已經(jīng)成為當(dāng)?shù)啬臼矸N植中的常見病害（表2）。

病害通常在木薯生長中期，7月以后開始發(fā)生，隨后流行為害，后期隨著氣溫下降逐漸減輕。當(dāng)前主栽的華南系列、桂熱系列、南植系列等絕大多數(shù)主栽品種以及新育成的H1071、JG1301等種質(zhì)均受害。在病害流行高峰期，云南保山地區(qū)的華南205、桂熱4號，廣西武鳴地區(qū)的H1071、桂熱4號和南植199，海南?？诤臀牟貐^(qū)的華南10號等品種（或種質(zhì)）的株發(fā)病率均在70%以上。

田間條件下，病原菌主要危害葉片，通常中下部葉片最先受害，隨后向上擴(kuò)展。葉片受侵染后，形成近圓形或不規(guī)則形的病斑。病斑最初為白色，后期黃褐色，直徑1.5～7.0 mm，其邊緣下陷，厚度約為正常葉片的一半（圖1）。病斑背面邊緣通常為褐色，周圍有黃色暈圈，田間濕度大時可見灰白色點狀物，為病原菌子實體。病斑在葉片上常成片密集分布，生長后期偶有單獨分布。

發(fā)病葉片隨后變黃，提前脫落。不同品種之間病斑的大小、顏色、落葉情況等略有差異。病害嚴(yán)重發(fā)生時，中下部葉片大量脫落，嚴(yán)重影響木薯的長勢和產(chǎn)量。

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，華南10號和H1071受害尤為嚴(yán)重，植株受侵染后，中部和下部絕大部分葉片上出現(xiàn)大量密集分布的白色至黃褐色的典型病斑。2015年廣西武鳴地區(qū)的H1071和2017、2018年海南文昌的華南10號植株受害后發(fā)病葉片大量脫落。

2.2木薯白點病病原菌的分離和致病性鑒定

2016年10月，在海南省海口市演豐鎮(zhèn)受害木薯華南10號植株上采集白點病病樣，病原菌分離并經(jīng)單孢純化后，編號為CAAHN01。2017年8月，在種植5個月的華南10號木薯植株上，采用孢子液噴霧法對中下部葉片進(jìn)行接種，14 d后接種葉片上形成密集分布、和田間癥狀類似的白色至黃褐色小病斑，而接種無菌水的對照葉片無任何癥狀（圖2）。從接種后病斑上重新分離獲得了培養(yǎng)性狀和分生孢子形態(tài)與最初分離物一致的分離物，表明該菌株為該病的致病菌。

2.3木薯白點病病原菌的鑒定

2.3.1 ?CAAHN01的形態(tài)觀察??在PDA平板上，CAAHN01菌落為圓形，邊緣整齊，中間灰色，邊緣白色，氣生菌絲和基內(nèi)發(fā)達(dá)（圖3）。菌絲分隔，多分枝。分生孢子梗為單生或簇生，直或彎曲。短喙柱狀，淡褐色。分生孢子大小為27.2～ 40.0?μm×8.1～12.8 μm，單生或短鏈生，倒棍棒狀或倒梨形，淺褐色或褐色，具有3～7個橫隔膜和1～3個縱、斜隔膜，多數(shù)為3～5個橫隔膜，分隔處略隘縮（圖4）。根據(jù)上述形態(tài)特征，參考張?zhí)煊?sup>[16]的描述，初步鑒定該病原菌為鏈孢霉目（Moniliales）黑霉科（Dematiaceae）鏈格孢屬（Alternaria）的鏈格孢（Alternaria alternata）。

Tub2-u和Tub2-d引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得大小約0.6 kb的目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物用ITS1和Tub2-d引物進(jìn)行測序后，分別獲得566和533 nt，序列已提交NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號為MH572535和MH572536。序列比對結(jié)果表明，MH572535與分離自受污染木制雕塑的鏈格孢菌株Su-VIII-1序列（MF475920）完全一致^[17]，與侵染黑色苦莓的鏈格孢菌分離物15-322（LC131450）和15-246（LC131446）、侵染葡萄的菌株HMY 2-1（KJ739880）的序列同源性為99%，而MH572536和侵染紫花苜蓿的鏈格孢菌株MP23（KJ396336）和MP39（KJ396337）、侵染枇杷的鏈格孢菌株P(guān)AK38（KY126829）、侵染茶樹的菌株CS36-5（KY814630）和CS36-3（KY814628）（未發(fā)表資料）的同源性為99%，進(jìn)一步從分子水平證明其為鏈格孢。

2.4菌株CAAHN01的生物學(xué)特性測定

菌株培養(yǎng)結(jié)果表明，菌株CAAHN01在V9、Czapek、CMA、PDA、CA、PSA、OA、LB和EMA等培養(yǎng)基上均能生長，其中V9、OA、CA和CMA上生長速度最快（圖5A）。在分別添加不同的8種碳源或6種氮源的Czapek培養(yǎng)基平板上，CAAHN01均能生長，其中以D-麥芽糖、D-山梨醇、D-乳糖為碳源以及以硝酸鈉為氮源的條件下生長最快（圖5B，圖5C）。在PDA培養(yǎng)基平板上，菌株在4～37?℃均能生長，但28?℃生長速度最快（圖5D）;光暗交替和pH 8條件下，菌落生長速度最快（圖5E，圖5F）。分生孢子在10～40?℃均能萌發(fā)，28?℃時萌發(fā)率最高（圖6A），致死溫度為60?℃處理5 min（圖6B）。

2.5室內(nèi)殺菌劑篩選

10種殺菌劑的各處理濃度對數(shù)與生長抑制率幾率值之間呈線性相關(guān)，其濃度對數(shù)-抑制率幾率值的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)、和EC₅₀等見表3。從表3中可以看出，10%苯醚甲環(huán)唑WG和25%吡唑醚菌酯WG抑菌效果優(yōu)于其他殺菌劑，EC₅₀≤0.47?mg/L，其中10%苯醚甲環(huán)唑WG的EC₅₀最小。50%異菌脲WP和14%咪鮮胺錳鹽WP的EC₅₀≤2.04 mg/L，優(yōu)于其他6種殺菌劑。2%春雷霉素AS的EC₅₀為11.41 mg/L，優(yōu)于其他4種。80%代森錳鋅WP和80%烯酰嗎啉WG的EC₅₀≥48.87 mg/L，效果僅優(yōu)于75%百菌清WP、50%多菌靈WP和70%甲基托布津WP，而這2種殺菌劑的EC₅₀≥2276.38 mg/L。10種殺菌劑的抑菌效果排序為：10%苯醚甲環(huán)唑WG（三唑衍生物類）>25%吡唑醚菌酯WG（甲氧基丙烯酸酯類）>50%異菌脲WP（二甲酰亞胺類）>14%咪鮮胺錳鹽WP（咪唑類）>2%春雷霉素AS（農(nóng)用抗生素類）>80%代森錳鋅WP（取代苯類）>80%烯酰嗎啉（嗎啉類）WG>75%百菌清WP（取代苯類）>50%多菌靈WP（苯并咪唑衍生物類）>70%甲基托布津 WP（取代苯類）。

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