胡椒蔓和葉粗提物成分分析及對3種農(nóng)業(yè)病原真菌活性研究

趙方方 韓丙軍 李萍萍 馬晨 呂岱竹 謝德芳 羅金輝

摘 ?要??采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對胡椒蔓和葉中化學(xué)成分種類及含量進(jìn)行系統(tǒng)分析，并考察提取物對3種重要農(nóng)業(yè)病原真菌的作用。結(jié)果表明，胡椒蔓和葉中化學(xué)成分種類復(fù)雜，而且減壓濃縮與自然揮發(fā)相比得到的種類更多。胡椒蔓中胡椒堿相對含量最高，達(dá)到34.97%;胡椒葉中烯類化合物種類繁多，以δ-欖香烯最高，相對含量達(dá)到13.268%。除了胡椒堿、烯類等特征性成分，還含有大量如酸酯類、化學(xué)結(jié)構(gòu)帶環(huán)或橋的酮、醇類化合物以及甾醇類化合物。胡椒蔓和葉提取物在2.5?mg/mL濃度下即對3種農(nóng)業(yè)病原真菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其中對番茄早疫病菌的抑制作用最為明顯，而且葉提取物對3種病原菌的抑制作用明顯優(yōu)于蔓提取物，同時得出2種提取物對3種真菌的毒力回歸方程及EC₅₀等表征參數(shù)。研究表明，胡椒蔓和葉在農(nóng)業(yè)病原菌防治中具有良好的開發(fā)潛力和利用價值。

關(guān)鍵詞 ?胡椒蔓;胡椒葉;化學(xué)成分;病原真菌;抑制作用中圖分類號??S567.23??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

Extracts from Tendrils and Leaves of Piper nigrum?Linn.：Components Analysis and Activity to Three Types of Agricultural Pathogenic Fungi

ZHAO Fangfang^1，2， HAN Bingjun^1，2，?LI Pingping^1，4， MA Chen^1，3， LYU?Daizhu^1，2， XIE Defang^1，2，?LUO Jinhui^{1，2，3，4*}

1. Analysis?& Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan?571101， China; 2.?Laboratory?of?Quality?&?Safety?Risk?Assessment?for?Tropical?Products?（Haikou）， Ministry?of?Agriculture?and Rural Affairs， Haikou， Hainan?571101， China; 3.?Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan?571101， China; 4.?Quality?Supervision?and?Inspection?Center?of?Tropical?Agro-Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan?571101，?China

Abstract ?The ingredients in the?tendrils and leaves ofPiper nigrumLinn.?were analysed by the GC-MS method， including types and amounts of the chemicals. The activities of the extracts?to three types of critical agricultural fungi were also investigated. The results?showed that abundant volatiles were included?in the tendrils and leaves.?More components were obtained by the way of decompressing concentration?than natural volatilization. Relative content of piperine was the highest in the tendrils， about 34.97%， while?that of olefins compounds were more in?the leaves， represented by δ-elemene at 13.268%. Besides these characteristic components， plenty of fatty acids， esters， ketones and alcohols with rings or bridges were also obtained， as well sterols. The extracts?at the concentration of 2.5 mg/mL evidently inhibited three types of agricultural fungi， most intensively onAlternariasolani. Furtherly， the extracts?of the leaves demonstrated more inhibition on these fungi than the extracts?of the tendrils. Toxic regression equations of the extracts to the fungi and the characterization parameters， such as EC₅₀， were also calculated. Potential exploration and utilization?value of the waste?ofP.nigrumLinn.?in the prevention and treatment of agricultural pathogenic fungi were?indicated by the results.

Keywords ?tendrils?ofPiper nigrumLinn.; leaves?ofPiper nigrumLinn.;?chemical components; pathogenic fungi; inhibition

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.017

胡椒（Piper nigrumLinn.）屬胡椒科胡椒屬多年生常綠藤本植物，是世界上重要的熱帶香辛料作物^[1]。中國胡椒種植面積和產(chǎn)量分別居世界的第6位和第5位，我國自1947年引入胡椒以來已在海南、云南、廣西、廣東和福建等省廣泛種植，其中海南省占據(jù)90%以上^[2-3]。胡椒從種植到收獲過程中會產(chǎn)生大量廢棄物，根據(jù)在海南省國營東昌農(nóng)場和東紅農(nóng)場的布點(diǎn)測算實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，每年每公頃結(jié)果胡椒樹在栽培管理過程中對胡椒樹進(jìn)行整形剪蔓會產(chǎn)生鮮胡椒枝蔓約10?500?kg。但是，目前胡椒廢棄物大都被隨意丟棄，開發(fā)不充分，造成巨大的資源浪費(fèi)^[4]。胡椒栽培管理過程中所產(chǎn)生的主要廢棄物胡椒蔓和胡椒葉中蘊(yùn)含著豐富的活性化學(xué)物質(zhì)，具有巨大的開發(fā)利用價值^[5-10]。

目前，對胡椒的研究大都集中在對胡椒粒和胡椒根中化學(xué)成分的分析，而對胡椒廢棄物中化學(xué)成分的研究還少有報(bào)道^[11-14]。葛暢等^[15]對胡椒鮮果果皮中糖類、有機(jī)酸、皂苷等進(jìn)行了定性分析。張水平等^[16-17]從胡椒葉中分離得到兩種抗氧化活性的物質(zhì)扁柏脂素和野漆樹苷。王延輝等^[18]對胡椒梗中揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，并比較了胡椒梗與胡椒中提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制能力。而胡椒主要廢棄物胡椒蔓及胡椒葉中化學(xué)成分及其對農(nóng)業(yè)病原菌的活性研究尚未見報(bào)道。

本研究以廢棄胡椒蔓和葉為材料，對其化學(xué)成分進(jìn)行分析，并分別對其提取物進(jìn)行3種農(nóng)業(yè)病原真菌的抑菌活性研究，以期為胡椒廢棄物高效資源化綜合利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，對避免資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，提高胡椒的附加值和利用率，促進(jìn)胡椒產(chǎn)業(yè)化升級都具有十分重要的意義。

1??材料與方法

1.1材料

胡椒蔓和胡椒葉樣品：采集于海南省瓊海市胡椒種植基地，日曬后40?℃烘箱干燥待用。番茄早疫病菌（Alternaria solani）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）由廣東省微生物菌種保藏中心提供。Agilent 7890A-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司），R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司），萬分之一天平（SHIMAZU），恒溫培養(yǎng)箱，95%乙醇（分析純）、甲醇、正己烷、丙酮（色譜純）。

1.2方法

1.2.1??化學(xué)成分的提取??采用2種蒸干方法進(jìn)行化學(xué)成分的提取。胡椒蔓和葉樣品分別經(jīng)小型粉碎機(jī)打碎、過篩后，稱取6.5 g樣品于1?L棕色玻璃瓶中，加入600 mL?95%乙醇，超聲2?h后置于通風(fēng)櫥內(nèi)浸泡48?h，浸泡液經(jīng)過濾后收集濾液。方法一：分次吸取濾液至250?mL圓底燒瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40?℃蒸發(fā)至近干，用丙酮定容，過0.22??m濾膜，待測;方法二：將濾液置于蒸發(fā)皿中自然揮干，用丙酮定容，過0.22??m濾膜，待測。

1.2.2??氣相色譜條件??色譜柱：DB-1 123-1033（30 m×0.32 mm×1 μm）;升溫程序：200 ℃保持1 min，以15?℃/min升至260?℃，保持10 min，以20?℃/min升至280?℃，保持4 min;進(jìn)樣口溫度：250 ℃;載氣：氦氣，流速：6.5 mL/min;進(jìn)樣量：1 μL;進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.2.3 ?質(zhì)譜條件??離子源為EI源，離子源溫度為230?℃，接口溫度為250?℃，溶劑延遲時間為2?min，掃描質(zhì)量范圍為60～550 amu。

1.2.4??乙醇粗提物的制備??稱取300 g樣品于4 L棕色玻璃瓶中，加入4 L?95%乙醇，超聲2?h后浸泡48?h。浸泡液經(jīng)過濾后收集濾液，減壓蒸發(fā)，獲得提取液浸膏置于4?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ?抑菌實(shí)驗(yàn)??本研究選取了3種重要的農(nóng)業(yè)病原真菌為研究對象，分別考察胡椒蔓、葉提取物對其抑制作用，實(shí)驗(yàn)采用帶毒平板法進(jìn)行。預(yù)先將斜面培養(yǎng)基上的菌種復(fù)蘇在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，得到接種菌落備用。無菌條件下分別稱取不同量的蔓、葉浸膏，加入二甲基亞砜和吐溫-80進(jìn)行助溶，待PDA培養(yǎng)基冷卻至45?℃左右（不燙手）時，將定量體積的PDA培養(yǎng)基與浸膏溶液中輕輕混勻，使二甲基亞砜和吐溫-80的體積濃度均為1.5%，提取物的梯度濃度分別為20、10、5、2.5、1.25 mg/L。迅速將混合培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中冷凝。選取培養(yǎng)平板上生長狀況一致的菌落，用滅菌的打孔器（直徑4?mm）平板環(huán)形打取菌餅，并將菌餅接種至上述帶浸膏的平板上。每個濃度和菌株在平板中接種3個菌餅為平行實(shí)驗(yàn)。對照組除不加提取物浸膏外，其他條件與實(shí)驗(yàn)組一致。所有平板至于恒溫培養(yǎng)箱中28?℃培養(yǎng)。長到合適大小時用十字交叉法對每個菌落直徑測量2次求直徑平均，3個菌落再次取平均，計(jì)算抑制率，抑制率=（對照組菌落平均半徑–實(shí)驗(yàn)組菌落平均半徑）/對照組菌落平均半徑×100%。根據(jù)提取物濃度和抑制率，使用SPSS 19.0軟件求出毒力回歸方程，并計(jì)算EC₅₀值等。

2??結(jié)果與分析

2.1化學(xué)成分

對胡椒蔓和胡椒葉進(jìn)行GC-MS分析，方法一與方法二分別提取胡椒蔓和胡椒葉的總離子流見圖1。從圖1中可以看出，胡椒蔓和胡椒葉的化學(xué)成分非常復(fù)雜，經(jīng)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析處理，均得到100多種組分，按照面積歸一法確定各組分的相對百分含量，其中匹配度在90%以上的物質(zhì)對應(yīng)的化合物見表1和表2，2種方法提取胡椒蔓和胡椒葉中化學(xué)成分的相對含量見圖2。由表1和表2可知，方法一與方法二提取胡椒蔓分別鑒定出34和14種化合物，提取胡椒葉分別鑒定出43和11種化合物。方法一（減壓濃縮法）更能保留胡椒蔓和胡椒葉中大部分特征化合物。

由表1和圖2A可以看出，胡椒蔓中主要化學(xué)成分是胡椒堿、烯類（如石竹烯、欖香烯、芹子烯）、酸酯類（如肉豆蔻酸、亞油酸乙酯）、

醇類（如3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、葉綠醇）、甾醇類（如菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇）及酮醛類等，其中胡椒堿占大多數(shù)，方法一和方法二中胡椒堿相對含量分別達(dá)到34.97%和34.06%。

由表2和圖2B可以看出，胡椒葉中主要化學(xué)成分是烯類（如欖香烯、（+）-香橙烯、石竹烯、α-古巴烯、α-蓽澄茄油烯、a-古云烯等24種化合物）、胡椒堿、醇類（如合金歡醇、橙花叔醇、斯巴醇等）、甾醇類（γ-谷甾醇）、酸酯類（如棕櫚酸、香茅酸甲酯等）、酮醛類等，其中烯類化合物占大多數(shù)，方法一中相對含量達(dá)到28.84%，以δ-欖香烯最高，相對含量達(dá)到13.268%。

胡椒植株具有獨(dú)特的辛香氣味，這與其體內(nèi)的化學(xué)成分具有重要的關(guān)系，特別是烯類、醇類和酸酯類化合物對其氣味起著重要作用;而胡椒堿是胡椒具有辛辣味的主要來源之一。另外，有很多物質(zhì)如石竹烯、欖香烯、α-蓽澄茄油烯、胡椒堿、斯巴醇、香茅酸甲酯等具有抑菌的生物活性^[19-20]。此外，還有谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等甾體類可能在其生長過程中產(chǎn)生重要作用。

2.2提取物抑菌效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡椒蔓和葉的提取物對這3種病原真菌生長均呈現(xiàn)出一定的抑制作用，不僅菌落擴(kuò)展半徑受到明顯抑制而且菌絲密度顯著降低，而且隨著提取物濃度增加，抑制作用加強(qiáng)，呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系（圖3，圖4）。3種病原菌中，對番茄早疫病病原菌的抑制效果最為明顯，2.5?mg/mL的胡椒蔓提取物對番茄早疫病病原菌的抑制即超過35%，而對灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀

菌的抑制效果相對較低，但效果仍然比較明顯，濃度為10 mg/mL時對其抑制率分別為41%和36%。與胡椒蔓提取物相比，胡椒葉提取物的抑制作用更突出，2.5?mg/mL的葉提取物對番茄早疫病病原菌的抑制率即超過胡椒蔓提取物10?mg/mL的效果，達(dá)到55%。10 mg/mL的葉提取物對另外2種真菌的抑制率也超過了50%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡椒葉提取物對這3種病原真菌的抑菌效果比胡椒蔓好，這可能與其所含有的多種烯類化合物如欖香烯、石竹烯有關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道這些成分具有明顯的抗菌效果^[21-22]。表3中計(jì)算出了胡椒蔓和葉提取物對3種病原菌的毒力方程及EC₅₀值，線性相關(guān)度良好，其中蔓的浸提物對灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌的抑制效果相對較差，而且濃度效應(yīng)不明顯，因此其EC₅₀值的誤差相對較大，故表中將其省略。

本研究所采用的3種病原菌是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中引起嚴(yán)重?fù)p失的重要種類，能夠引起果樹，蔬菜、花卉、茶葉等百余種作物的病害，造成較為嚴(yán)重的危害^[23-25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡椒修剪所產(chǎn)生的廢棄物所含的化學(xué)成分均能夠起到較為明顯的抑制作用，能夠?yàn)橹参锊∠x害的生物防治和綠色防控提供較為有效的研究材料，可以應(yīng)用于有機(jī)食品及無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中的病蟲害防控研究，同時，作為農(nóng)田廢棄物價廉易得，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中較為合適，具有較大的應(yīng)用潛力和開發(fā)價值。

3??結(jié)論

本研究以胡椒修剪過程中產(chǎn)生的廢棄物胡椒蔓和葉為研究對象，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別對其乙醇提取物中化學(xué)成分進(jìn)行研究。結(jié)果表明，其成分復(fù)雜，涉及化合物種類眾多，不僅含有胡椒的多種特征性組分，而且還含有具有抗菌活性的揮發(fā)性物質(zhì)。進(jìn)一步將蔓和葉提取物添加到培養(yǎng)基中，考察其潛在的抗菌效果。通過對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對于包括番茄早疫病病原菌在內(nèi)的3種重要的農(nóng)業(yè)病原真菌具有較好的抑制作用。

隨著綠色農(nóng)業(yè)和可持續(xù)發(fā)展理念的推進(jìn)，病蟲害的綠色防控技術(shù)勢在必行，這就需要開發(fā)大量的天然抗菌材料。本研究證明了胡椒廢棄物具有較好的抗菌活性，具備成為抗菌天然材料的潛力。同時，胡椒在生產(chǎn)過程中需要定期進(jìn)行枝條修剪，剪掉的部分通常被視為廢棄物丟棄，長期大面積的種植會產(chǎn)生大量的枝蔓廢棄物，造成資源的巨大浪費(fèi)。本研究使用乙醇浸提的方法，操作簡單，成本低廉，對環(huán)境無污染，適合在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，可以為作物病蟲害生物防治和綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供有效的材料。同時，這一理論研究符合農(nóng)業(yè)“兩減”的政策和目標(biāo)要求，符合綠色和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的概念，具有潛在的開發(fā)和利用價值。

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