菜心小孢子發(fā)育時(shí)期與花器官形態(tài)的相關(guān)性

龐強(qiáng)強(qiáng) 李德明 周曼 朱白婢 趙樞紐 蔡興來

摘 ?要??研究菜心小孢子不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征及其與花器官外部形態(tài)的相關(guān)性，為直接從花器官外部形態(tài)特征來判斷小孢子發(fā)育時(shí)期提供依據(jù)。結(jié)果表明，菜心小孢子發(fā)育分為四分體時(shí)期、單核期和雙核期，各時(shí)期特征明顯。菜心小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾和花藥外部形態(tài)特征密切相關(guān)，供試菜心材料中處在單核靠邊期的花蕾縱徑為3.05～?3.39?mm，花萼長(zhǎng)為3.25～3.46?mm，花瓣長(zhǎng)為2.10～2.33?mm，瓣萼比為0.63～0.71，花藥長(zhǎng)為2.57～2.89?mm、瓣藥比為0.77～0.85，適合作為不同材料花蕾最佳取樣時(shí)期的鑒定指標(biāo)。處在單核靠邊期的花器官外觀特征表現(xiàn)為花蕾飽滿，萼片綠色并包被著花冠，花瓣和花藥均為淺黃色，花藥略長(zhǎng)于花瓣。可見，依據(jù)花器官形態(tài)特征可判斷菜心小孢子的發(fā)育時(shí)期及所對(duì)應(yīng)的選蕾標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞 ?菜心;小孢子;發(fā)育時(shí)期;花器官;形態(tài)特征中圖分類號(hào)??S634.5?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Correlation of Microspore Development Period and Flower Morphological Characteristics of Chinese Flowering Cabbage

PANG?Qiangqiang， LI?Deming， ZHOU Man， ZHU?Baibi， ZHAO?Shuniu， CAI?Xinglai^*

Vegetable Research Institute， Hainan Provincial Academy of Agricultural Sciences?/ Hainan Provincial Key Laboratory for Vegetable and Biology?/ Hainan Provincial Engineering Research Center for Melon and Vegetable Breeding， Haikou， Hainan?571100， China

Abstract ?The cytological characteristics of microspores in Chinese flowering cabbage?at different developmental periods were studied to reveal?the relationship between microspore development and buds morphology， which would provide evidences?for the culturing of anthers?and microspores. The results showed that the microspore developed in?tetrad， early-?or mid-uninucleate， late-uninucleate and binucleate?stages?obviously.?The microspore development showed correlativity with the morphological characteristics of buds and anthers. The buds 3.05–3.39?mm in height， the calyx 3.25–3.46?mm in length， the petal 2.10–2.33?mm in length， the ratio of flap?to calyx 0.63–0.71， the anther 2.57–2.89?mm in length， and the ratio of flap 0.77–0.85 were discovered to contain microspores at the late uninucleate.?These were?suitable for the identification of optimal sampling period of flower buds in different materials. At the late uninucleate stage， it?was?necessary that the anthers should be covered by the sepal， the anthers slightly longer than petals， and the flower bud was full， the petals and anthers showed pale yellow. Therefore， we can judge the development stage of Chinese flowering cabbage?microspore by morphological characteristics of flower organs so as to define the standard of bud selection in correspondence with the optimal stage of anthers culture.

Keywords ?Chinese flowering cabbage; microspore; developmental period; flowers organs; morphological characteristics

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.008

菜心（Brassica rapa syn.?Campestris ssp. Chinensis var. UtilisTsen et Lee）又名菜薹，為十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物，由大白菜亞種和白菜亞種長(zhǎng)期選擇和栽培馴化而來，原產(chǎn)我國(guó)南部，是我國(guó)華南地區(qū)的特產(chǎn)^[1]，生長(zhǎng)周期短，在蔬菜周年供應(yīng)尤其是淡季蔬菜供應(yīng)上占有重要地位^[2]。菜心品質(zhì)脆嫩、風(fēng)味獨(dú)特，并伴有清熱解毒、殺菌、降血脂的功能^[3-4]， 因而具有“蔬品之冠”的美譽(yù)。菜心為異花授粉植物，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，但純合非常困難，利用一代雜種培育優(yōu)良的自交系親本一般需6～8代，要對(duì)所選單株進(jìn)行連續(xù)多代剝蕾自交純化，相當(dāng)費(fèi)工費(fèi)時(shí)，且長(zhǎng)期自交會(huì)出現(xiàn)自交衰退現(xiàn)象^[5-6]。應(yīng)用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體進(jìn)而加倍成后代完全純合的雙單倍體植株（DH植株），可在較短時(shí)間內(nèi)使材料得以純化，從而大幅度縮短育種年限，而游離小孢子培養(yǎng)體系的建立是關(guān)鍵所在^[7-8]。盡管小孢子培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但在實(shí)際操作中，小孢子培養(yǎng)受基因型^[9]、小孢子發(fā)育時(shí)期^[10]、供體植株所處的生理狀態(tài)^[11]、預(yù)處理^[12]、培養(yǎng)基^[13]等多種因素的影響，其中選擇適宜的小孢子發(fā)育時(shí)期是決定小孢子能否誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵因子之一。就多數(shù)植物而言，單核靠邊期的小孢子最容易形成小孢子胚^[14-16]。通過細(xì)胞學(xué)觀察可確定小孢子的發(fā)育時(shí)期，但此方法需檢查每一個(gè)花藥，既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且會(huì)對(duì)小孢子活力造成一定的損傷。前人在辣椒^[17]、黃瓜^[18]、蘿卜^[19]、青花菜^[20]和甘藍(lán)^[21]等多種植物上的研究結(jié)果表明，小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外部形態(tài)，如花蕾縱徑、花蕾橫徑、花藥長(zhǎng)、花藥寬、花瓣長(zhǎng)與花藥長(zhǎng)比值等密切相關(guān)，但不同品種和變種以及不同的栽培條件，其形態(tài)指標(biāo)有所不同。雖然菜心在花藥和小孢子培養(yǎng)方面已取得了很大進(jìn)展，但是目前還存在著許多問題，導(dǎo)致出胚率和成苗率不高^[22-23]。為此，本研究擬通過觀察菜心小孢子各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)，來探討其與花器官外部形態(tài)的相關(guān)性，以便能根據(jù)花器官形態(tài)來確定小孢子發(fā)育時(shí)期，為進(jìn)一步開展菜心小孢子培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

以海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所葉菜組提供的5個(gè)菜心品種為供試材料，分別為C01（油青菜心，早熟）、C02（四-九月菜心，晚熟）、C03（尖葉菜心，中熟）、C04（油綠粗薹菜心，早熟）、C05（尖葉70?d，晚熟）。2018年2月下旬在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院永發(fā)試驗(yàn)基地大棚內(nèi)進(jìn)行育苗，待幼苗長(zhǎng)至5片真葉時(shí)定植于試驗(yàn)田，常規(guī)栽培管理直至抽薹開花。于晴天上午8：00左右采摘健康且長(zhǎng)勢(shì)較好的植株上的花蕾，取樣時(shí)主花序上的花蕾優(yōu)先，其次為第一、第二分枝上的花蕾。

1.2方法

1.2.1??花蕾外部形態(tài)觀察??采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量菜心花蕾橫徑、花蕾縱徑、花萼長(zhǎng)和花瓣長(zhǎng)并記錄其形態(tài)特征，再將花萼、花瓣去除，取出花藥切除花絲后，分別測(cè)量花藥長(zhǎng)度和花藥寬度，記錄花藥顏色。每個(gè)發(fā)育時(shí)期觀察并測(cè)量20個(gè)花蕾，重復(fù)3次。

1.2.2??小孢子不同發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)觀察??將各材料不同長(zhǎng)度的花蕾（圖1）置于卡諾氏固定液（冰醋酸∶95%酒精為1∶3）中固定24?h后，轉(zhuǎn)移到70%酒精中，于0～4?℃冰箱中保存。制片時(shí)，用鑷子將花藥從固定的花蕾中取出置于載玻片上，并輕輕擠出花粉，用DAPI 熒光染液染色、壓片，制成臨時(shí)制片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，確定其所處的發(fā)育時(shí)期，每次觀察重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)初處理采用Excel 2007軟件，差異顯著性分析采用Duncan法。

2??結(jié)果與分析

2.1菜心小孢子各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征

菜心不同發(fā)育時(shí)期花蕾的顯微觀察結(jié)果見圖2。四分體時(shí)期，小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂后，形成由胼胝質(zhì)包圍的4個(gè)細(xì)胞，經(jīng)染色后有4個(gè)細(xì)胞核出現(xiàn)，此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈現(xiàn)為明顯的四裂狀（圖2A）;隨后，酶催化四分體胼胝質(zhì)壁水解，釋放出的小孢子很快由不規(guī)則的外形輪廓變成圓形或近圓形，整個(gè)細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核只有1個(gè)且處于細(xì)胞正中央，即單核中期（圖2B）;之后，小孢子體積逐漸增大，絨氈層細(xì)胞解體并為小孢子提供充足營(yíng)養(yǎng)，中央大液泡開始形成，細(xì)胞核從中心被擠壓到靠近細(xì)胞壁，此時(shí)外形可見3 條較為明顯的萌發(fā)溝，形成花粉外壁，即為單核靠邊期（圖2C）;最后，單核花粉細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育獲得充實(shí)后進(jìn)行第1次有絲分裂，由于是不均等分裂，因此形成1個(gè)體積較大靠近液泡的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和1個(gè)體積較小貼近細(xì)胞壁的生殖細(xì)胞，2個(gè)核形狀均為圓球形（圖2D）;花粉粒再膨大，最終發(fā)育成外壁成熟花粉粒。

2.2菜心小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)特征的相關(guān)性

由表1可知，菜心小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外部形態(tài)特征關(guān)系密切。同一菜心品種花蕾的各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)，如花蕾縱徑、花蕾橫徑、花萼長(zhǎng)、花瓣長(zhǎng)均隨小孢子發(fā)育逐漸成熟呈顯著或極顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)。處于同一發(fā)育時(shí)期的花蕾各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)在不同菜心品種間也存在差異。四分體時(shí)期的小孢子花蕾縱徑為1.90～2.21?mm，花蕾橫徑為1.47～1.72?mm，花萼長(zhǎng)為1.77～2.32?mm，花瓣長(zhǎng)為0.63～0.76?mm，瓣萼比為0.33～0.41;花蕾縱徑為2.46～2.68 mm，花蕾橫徑為1.69～1.89?mm，花萼長(zhǎng)為2.44～2.88?mm，花瓣長(zhǎng)為1.26～1.46?mm，瓣萼比為0.44～0.58，此時(shí)的小孢子處于單核早中期;當(dāng)花蕾縱徑為3.05～3.39?mm，花蕾橫徑為1.87～2.22?mm，花萼長(zhǎng)為3.25～3.46?mm，花瓣長(zhǎng)為2.10～2.35?mm，瓣萼比為0.63～0.71時(shí)，小孢子處于單核靠邊期;雙核期時(shí)花蕾的縱徑為3.62～3.88 mm，花蕾橫徑為2.31～2.49?mm，花萼長(zhǎng)為3.75～4.21?mm，花瓣長(zhǎng)為3.17～3.70?mm，瓣萼比為0.84～0.92。

2.3菜心小孢子發(fā)育時(shí)期與花藥形態(tài)特征的相關(guān)性

由表2可知，同一基因型不同發(fā)育時(shí)期的菜心小孢子，其花藥長(zhǎng)、花藥寬、瓣藥比均存在顯著或極顯著差異;不同基因型同一發(fā)育時(shí)期花藥形態(tài)指標(biāo)也存在差異。其中四分體時(shí)期的花藥長(zhǎng)為1.51～1.82 mm，花藥寬為0.52～0.63?mm，瓣藥比為0.41～0.44;單核早中期的花藥長(zhǎng)為2.08～?2.46?mm，花藥寬為0.61～0.83?mm，瓣藥比為0.51～0.68;單核靠邊期花藥長(zhǎng)為2.57～2.89?mm，花藥寬為0.82～1.01?mm，瓣藥比為0.77～0.85;雙核期的花藥長(zhǎng)為3.04～3.48?mm，花藥寬為0.97～1.07?mm，瓣藥比為1.00～1.22。

2.4菜心小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾和花藥外部形態(tài)變化的關(guān)系

由表3可知，隨著小孢子發(fā)育時(shí)期的變化，不同基因型菜心的花蕾和花藥外部形態(tài)也發(fā)生變化。適宜取材的單核靠邊期的花蕾膨大較明顯，花冠被萼片緊密包裹，花藥較花瓣略長(zhǎng)，花瓣和花藥均為淺黃色。

3??討論

植物小孢子發(fā)育可分為四分體時(shí)期、小孢子時(shí)期和成熟花粉粒時(shí)期，其中小孢子時(shí)期又包括單核早期、單核中期、單核靠邊期和雙核期。對(duì)于小孢子培養(yǎng)而言，并非任何發(fā)育時(shí)期的小孢子都適合?；ɡ侔l(fā)育時(shí)期過早，小孢子尚未形成，此時(shí)受外界環(huán)境影響較大，幾乎不能培養(yǎng)成胚^[24];選取發(fā)育過晚的小孢子由于其因?yàn)槭ッ摲只芰?，?dǎo)致小孢子發(fā)育進(jìn)程中斷^[25]。由此可見，小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)于小孢子培養(yǎng)成功與否起著決定性的作用。不同作物的小孢子最適培養(yǎng)時(shí)期不同，同一作物不同研究者得到的結(jié)果也有不同。Takahata等^[26]在研究甘藍(lán)時(shí)發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期至雙核期。詹艷等^[16]研究發(fā)現(xiàn)，單核靠邊期是進(jìn)行黃瓜游離小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期，謝淼等^[27]研究發(fā)現(xiàn)，處于單核中后期的黃瓜小孢子易于誘導(dǎo)出胚。袁素霞等^[28]選取單核靠邊期的結(jié)球甘藍(lán)和青花菜花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，成功獲得了約7000份小孢子再生植株。

本研究發(fā)現(xiàn)菜心小孢子發(fā)育過程不僅可劃分為不同階段，而且小孢子發(fā)育階段與花器官各形態(tài)指標(biāo)關(guān)系密切，因此可以根據(jù)花蕾形態(tài)、大小和花藥發(fā)育情況來判斷菜心小孢子的發(fā)育時(shí)期。在十字花科蔬菜上的研究表明，處于單核靠邊期的小孢子易于誘導(dǎo)出胚狀體^[29-31]。通過觀察5份菜心材料小孢子發(fā)育不同時(shí)期的花蕾和花藥形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，不同菜心材料的小孢子處于單核靠邊期的花蕾表現(xiàn)為花蕾飽滿，萼片綠色并包被著花冠，花瓣和花藥均為淺黃色，花藥略長(zhǎng)于花瓣，即花蕾縱徑為3.05～3.39?mm，橫徑為1.97～?2.22?mm，花萼長(zhǎng)為3.25～3.46?mm，花瓣長(zhǎng)為2.10～2.33?mm，瓣萼比為0.63～0.71，花藥長(zhǎng)為2.57～2.89?mm，花藥寬為0.84～1.01?mm，瓣藥比為0.77～0.85，此時(shí)就單個(gè)品種來說，這些指標(biāo)均可作為確定小孢子發(fā)育適期花器官特征的參考。通過比較不同菜心材料花器官在單核靠邊期的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，花蕾橫徑和花藥寬在不同基因型之間差異均較大，不易找到統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)來確定最適花蕾大小，如C02單核靠邊期的花蕾橫徑為1.87?mm，與C04單核早中期的1.89?mm接近。對(duì)于所有供試材料來說，單核靠邊期的花蕾縱徑、花萼長(zhǎng)、花瓣長(zhǎng)、瓣萼比、花藥長(zhǎng)和瓣藥比與其他發(fā)育時(shí)期的同類指標(biāo)相比不存在尺度上的重疊，因此它們更適合作為不同材料最適取樣時(shí)期的鑒定指標(biāo)，這與前人在菜心上的報(bào)道也較為類似。如朱允華^[32]在菜心花藥和花粉培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花瓣達(dá)到花藥長(zhǎng)度的1/2～4/5、花藥淺黃色、花蕾長(zhǎng)為2.5～3.5?mm時(shí)，大多數(shù)的小孢子處于單核靠邊期。吳藝飛等^[33]用瓣萼比在0.626～0.834的花蕾成功進(jìn)行了紅菜薹小孢子培養(yǎng)。比較而言，前人在菜心等作物的小孢子培養(yǎng)研究中不曾采用瓣萼比這一指標(biāo)，本文豐富了菜心小孢子培養(yǎng)的研究結(jié)果。在實(shí)際應(yīng)用中，如果菜心小孢子最佳培養(yǎng)時(shí)期以單核靠邊期為準(zhǔn)，則可依據(jù)本研究結(jié)果來判斷，以此實(shí)現(xiàn)在田間直接取材而不需要鏡檢，這對(duì)菜心小孢子培養(yǎng)具有重要意義。然而在進(jìn)行菜心小孢子培養(yǎng)時(shí)，除上述影響因素外，還要考慮供體植株的基因型、生長(zhǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基、預(yù)處理等因素對(duì)培養(yǎng)效率的影響。

參考文獻(xiàn)

[1]?李桂花， 陳漢才， 張??艷， 等. 菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（4）： 110-114.

• 馬三梅， 王永飛. 菜心育種的研究進(jìn)展[J]. 北方園藝， 2006（3）： 40-41.
• 張運(yùn)紅， 和愛玲， 孫克剛， 等. 海藻酸鈉寡糖對(duì)菜心類囊體膜組成及特性的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 25（1）： 129-135.?
• 任錫亮， 王毓洪， 孟秋峰， 等. 菜心栽培技術(shù)[J]. 寧波農(nóng)業(yè)科技， 2007（3）： 24-25.
• 朱允華， 劉明月， 吳朝林. 影響菜心游離小孢子培養(yǎng)的因素[J]. 長(zhǎng)江蔬菜， 2003（9）： 46-47.
• 黃旺亞， 郭漢權(quán). 菜心種子加工技術(shù)[J]. 廣東農(nóng)村實(shí)用技術(shù)， 2010（11）： 37-38.
• 王春麗， 王濤濤， 張余洋， 等. 青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究[J]. 中國(guó)蔬菜， 2010， 1（4）： 36-40.
• 韓??碩， 郭??寧， 張?jiān)略疲?等. 羽衣甘藍(lán)雙單倍體育種技術(shù)研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2018， 26（3）： 521-529.
• 孫??丹， 王濤濤， 葉志彪， 等. 基因型和活性炭對(duì)大白菜小孢子胚胎發(fā)生的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005（6）： 73-75.
• 楊宏光， 孫曉梅， 王孝鵬， 等. 三色堇小孢子發(fā)育時(shí)期與花器形態(tài)相關(guān)性分析[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 39（5）： 621-624.
• 曹鳴慶， 李??巖. 基因型和供體植株生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 1993， 8（4）： 1-6.
• 高素燕， 李??英， 單曉政， 等.?預(yù)處理對(duì)不結(jié)球白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 24（6）： 878-881.
• 趙大芹， 陶??蓮， 張朝君， 等. 培養(yǎng)基成分對(duì)黔白大白菜雜交種小孢子胚誘導(dǎo)的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 35（6）： 24-25.
• 王??娜， 賈??凱， 妥秀蘭， 等. 蕪菁小孢子培養(yǎng)及其胚狀體離體發(fā)育過程[J].?西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 25（9）： 1392-1398.
• 張孟利， 張恩慧， 許忠民， 等. 栽培因素影響甘藍(lán)花蕾小孢子發(fā)育同步性研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2018（1）： 9-14.
• 詹??艷， 陳勁楓， Ahmed Abbas Malik. 黃瓜游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)成胚和植株再生[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2009， 36（2）： 221-226.

[17]?胡??梅， 高??杰， 葛菊芬， 等. 辣椒花蕾長(zhǎng)度和單核靠邊期花粉細(xì)胞比例間的關(guān)系[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 21（9）： 10-12.

[18]?陳芬芬， 高??惠， 齊海軍， 等. 黃瓜花蕾大小與花粉發(fā)育時(shí)期相關(guān)性研究[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 38（2）： 134-138.

[19]?李??丹， 李錫香， 沈??鏑. 蘿卜小孢子不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)和花器官形態(tài)特征觀察[J]. 中國(guó)蔬菜， 2008（10）： 11-15.

[20]?袁建民， 木萬福， 楊??龍， 等. 青花菜小孢子發(fā)育時(shí)期與花器形態(tài)的相關(guān)性[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2016， 32（34）： 123-128.

[21]?張恩慧， 馬英夏， 楊安平， 等. 甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)中花蕾長(zhǎng)度與細(xì)胞單核期的關(guān)系[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 21（6）： 124-128.

[22]?朱允華， 劉明月， 吳朝林. 影響菜心游離小孢子培養(yǎng)的因素[J]. 長(zhǎng)江蔬菜， 2003（9）： 46-47.

[23]?曾小玲， 方淑桂， 朱朝輝， 等. 不同基因型菜心游離小孢子培養(yǎng)和植株再生[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（12）： 2397-2402.

[24]?梅德圣， 王漢中， 李云昌， 等. 油菜小孢子培養(yǎng)影響因素及黃籽油菜雙單倍體群體的構(gòu)建[J].?華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2007， 22（1）： 112-115.

[25]?戴希剛， 施雪萍， 包滿珠. 羽衣甘藍(lán)小孢子胚植株再生的影響因素分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2013， 41（7）： 201-208.

[26]?Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture ofBrassica oleraceaL.[J]. Plant Science， 1991， 74： 235-242.

[27]?謝 ?淼， 秦麗穎， 潘俊松， 等. 黃瓜花器形態(tài)發(fā)生、小孢子發(fā)育與花藥培養(yǎng)[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2005， 25（6）： 1096-1100.

[28]?袁素霞， 劉玉梅， 方智遠(yuǎn)， 等. 結(jié)球甘藍(lán)和青花菜小孢子胚植株再生[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2010， 45（2）： 226-232.

[29]?陳文輝， 方淑桂， 曾小玲， 等. 甘藍(lán)和青花菜雜種小孢子培養(yǎng)[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2006， 14（4）： 321-326.

[30]?趙前程， 吉立柱， 蔡榮旗， 等. 花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2007， 22（6）： 65-68.

[31]?李桂花， 王亭亭， 劉??凱， 等. 芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)研究初報(bào)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（8）： 1518-1525.

[32]?朱允華. 菜心花藥和花粉培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體的研究[D]. 長(zhǎng)沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2003.

[33]?吳藝飛， 丁茁荑， 肖 ?杰， 等. 紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 作物研究， 2016（1）： 73-77.