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    澳洲堅果油微乳體系的構(gòu)建

    2019-06-11 11:28:03涂行浩張帥中唐景華杜麗清帥希祥張明
    熱帶作物學報 2019年2期
    關(guān)鍵詞:粒徑穩(wěn)定性

    涂行浩 張帥中 唐景華 杜麗清 帥希祥 張明

    摘? 要? 為擴大澳洲堅果油應(yīng)用領(lǐng)域,構(gòu)建了澳洲堅果油微乳體系。以微乳區(qū)面積為評價指標,采用偽三元相圖法,并結(jié)合單因素試驗和Box-Behnken試驗,對表面活性劑、助表面活性劑種類及用量和制備溫度進行優(yōu)選,并對相圖中O/W型微乳中心區(qū)域的兩條可稀釋線上靠近中心的兩個微乳液配方的粒徑測定,評價微乳穩(wěn)定性。澳洲堅果油微乳液較佳的制備工藝為:吐溫60 (Tween 60)與聚氧乙烯氫化蓖麻油(PEG-40)質(zhì)量比2.5為混合表面活性劑、聚乙二醇400(PEG400)與澳洲堅果油質(zhì)量比3.5為混合油相、制備溫度60 ℃,可制備出微乳區(qū)面積較大,無色透明并可無限稀釋的微乳液,試驗得到SME為13.61%。微乳液在長期貯存和大量稀釋過程中,粒徑變化較小,穩(wěn)定性較好。

    關(guān)鍵詞? 澳洲堅果油;微乳區(qū)面積;Box-Behnken試驗;粒徑;穩(wěn)定性

    中圖分類號? TS201.2? ? ?文獻標識碼? A

    澳洲堅果(Macadamia integrifolia)是一種原產(chǎn)于澳大利亞的樹生堅果,也叫夏威夷果,因其果仁風味獨特、營養(yǎng)豐富以及經(jīng)濟價值高特點,被譽為“干果皇后”?,F(xiàn)已在我國熱帶地區(qū)廣泛種植,初步統(tǒng)計種植面積已超過150 hm2[1-2]。澳洲堅果果仁中含油70%~80%,且80%以上的脂肪酸是單不飽和脂肪酸,主要以油酸(約60%)和棕櫚油酸(約20%)為主,并含有大量生育酚和角鯊烯等活性成分,具有較高的保健價值及功能特性[3-4]。精制的澳洲堅果油呈淡黃色,除作為功能油脂食用外,還可用于高檔化妝品制造的原料[5]。特別是其脂肪酸組成和與皮脂類似,易于吸收,使它有利于作為皮膚護理產(chǎn)品以及抗衰老面霜的關(guān)鍵成分[6-7]。另外,多項研究表明,澳洲堅果油在預防癌癥[8]、降低炎癥[6]和降低膽固醇[9]等方面具有較好的功效。

    澳洲堅果油作為一種功能性油脂,受限于其水溶性的影響,市面上產(chǎn)品形式較為單一。為提高澳洲堅果油的溶解度和分散性,可通過制備微乳液、環(huán)糊精絡(luò)合以及脂質(zhì)體包封等方法改善。而微乳液具有制備工藝簡單、熱力學穩(wěn)定以及增溶性好等一系列優(yōu)點,且在藥物傳導體系已經(jīng)運用非常成熟,具有較好的應(yīng)用前景[10-12]。近年來微乳化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于常見植物油、色素以及精油等[13-17]的運載和包埋,不僅可以改善其水溶性[18],還能大幅度提升儲藏穩(wěn)定性[19]。制備微乳區(qū)域越大,意味著在一定范圍內(nèi)被大量稀釋后,其液滴形態(tài)和穩(wěn)定性可基本保持不變,即穩(wěn)定性越好[20-21]。本文以澳洲堅果油為油相,借助少量的外部能量如攪拌,以微乳區(qū)面積為指標,采用單因素試驗設(shè)計、Box-Behnken試驗設(shè)計成功構(gòu)建并優(yōu)選出可無限稀釋、澄清透明、穩(wěn)定性好的O/W型微乳液,為將來進一步擴大澳洲堅果油在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍提供技術(shù)依據(jù)。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    1.1.1? 材料及試劑? 澳洲堅果油:國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心澳洲堅果研發(fā)部提供,冷榨制取。

    吐溫80(Tween80,TW-80)、吐溫60(Tween60,TW-60)、吐溫20(Tween20,TW-20)、司盤80(Span80,SP-80)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(PEG-40)、甘油、1,2-丙二醇,均為食品級,山東優(yōu)索化工科技有限公司;聚乙二醇400(PEG 400),醫(yī)藥級,山東優(yōu)索化工科技有限公司;聚蓖麻酸甘油酯(PGPR),食品級,德國Merck公司;無水乙醇、正丁醇、亞甲基藍、蘇丹紅Ⅲ,國產(chǎn)分析純,國藥試劑有限公司。

    1.1.2? 儀器與設(shè)備? Nano-ZS90粒徑分析儀,英國Malvern儀器有限公司;ETS-D5加熱型磁力攪拌器,德國IKA公司;LVEM5臺式透射電子顯微鏡,Quantum量子科學儀器貿(mào)易(北京)有限公司;FV10i激光共聚焦顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司;ME-104精密型電子天平,Mettler Toledo中國有限公司。

    1.2? 方法

    1.2.1? 澳洲堅果油微乳的制備? 采用轉(zhuǎn)相乳化法制備澳洲堅果油微乳。將澳洲堅果油與助表面活性劑混合作為混合油相,分別按不同質(zhì)量比(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9)與表面活性劑混合均勻,在磁力攪拌的條件下逐滴加入去離子水,記錄體系由澄清透明變渾濁,再由渾濁變澄清透明時轉(zhuǎn)變點的臨界加水量,計算各組分(混合油相、表面活性劑、去離子水)的質(zhì)量分數(shù)。然后分別以混合油相、表面活性劑、水相為3個頂點,根據(jù)各組分質(zhì)量分數(shù)確定臨界點在相圖中的位置,將各點連接起來,繪制偽三元相圖,計算微乳區(qū)面積[15-16]。

    1.2.2? 微乳類型鑒定及形態(tài)觀察? 微乳類型用染色法鑒定[22];形態(tài)觀察分別在激光共聚焦顯微鏡及透射電子顯微鏡下進行[11, 23]。

    1.2.3? 微乳配方的初步篩選? (1)助表面活性劑的確定。將無水乙醇、1, 2-丙二醇、PEG400、甘油和正丁醇作為助表面活性劑,與澳洲堅果油按照3∶1配比作為混合油相,然后與表面活性劑TW-60/PEG-40(3∶1)混合均勻,按照1.2.1方法制備微乳。通過繪制偽三元相圖,比較各自形成的微乳區(qū)面積大小,確定最佳助表面活性劑種類。

    (2)單一表面活性劑的初步選擇。在前期預試驗的基礎(chǔ)上,篩選PEG400:澳洲堅果油=3∶1為較佳的混合油相比例,分別以TW-80、TW-60、TW-20、SP-80、PEG-40、PGPR作為表面活性劑,按照1.2.1方法制備微乳。通過肉眼觀察,以外觀均一透明,流動性好為作為微乳形成的標準[19],按照1.2.1方法制備微乳,1.2.2方法對微乳進行鑒定,初步篩選表面活性劑。

    (3)復合表面活性劑的篩選。將上述初步篩選得到的表面活性劑TW-60和PEG-40,分別按照質(zhì)量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5與SP-80復配,固定PEG400/澳洲堅果油(3∶1)為混合油相,按照1.2.1方法制備微乳,比較成乳狀況和最小可稀釋比(The minimum dilution ratio, DR),DR值為微乳擬三元相圖中可稀釋線所對應(yīng)的混合表面活性劑與堅果油的最小質(zhì)量比。

    1.2.4? 單因素試驗? 按照1.2.1中的方法制備微乳,分別考察TW-60與PEG-40質(zhì)量比、PEG400與堅果油質(zhì)量比和制備溫度對澳洲堅果油微乳的微乳區(qū)面積大小的影響。

    1.2.5? 響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化微乳配方? 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0.6軟件,按照Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗,對澳洲堅果油微乳配方進一步優(yōu)化。選擇TW-60與PEG-40質(zhì)量比(A)、PEG400與堅果油質(zhì)量比(B)、制備溫度(C)三個因素為考察因素,以微乳區(qū)面積SME為響應(yīng)值,確定最佳試驗條件。因素水平如表1所示。

    1.2.6? 微乳粒徑及多分散指數(shù)(Polydispersity index, PDI)的測定? 采用粒徑分析儀測定堅果油微乳的粒徑大小和PDI值[18]。平行測定3次,結(jié)果取平均值。

    1.3? 數(shù)據(jù)處理

    所有試驗重復3次,使用Microsoft Excel軟件、Design-Expert 8.0.6軟件和Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖和統(tǒng)計分析,AutoCAD 2010軟件用于計算微乳區(qū)面積。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 微乳配方初選結(jié)果

    2.1.1? 助表面活性劑的確定? 在微乳偽三元相圖中,微乳區(qū)面積(SME)大小與載油量、成乳能力以及穩(wěn)定性均密切相關(guān)。助表面活性劑通過滲透到表面活性劑分子之間的空隙,從而形成一個無序的混合膜,以此增加微乳界面柔韌性,減少其形成時所需的界面彎曲能,從而形成微乳。一般選擇短鏈醇作為助表面活性劑,且醇的鏈長對微乳的粒徑,分散性和穩(wěn)定性有著較大的影響[17, 19]。由圖1可知,當以PEG400為助表面活性劑時,形成的SME最大,顯著大于以無水乙醇、1, 2-丙二醇、甘油、正丁醇作為助表面活性劑時的SME(p<0.05),所以選擇PEG400為最佳助表面活性劑。

    2.1.2? 表面活性劑初選結(jié)果? 微乳制備過程中不同表面活性劑,對微乳的性質(zhì)及形成能力均有較大影響。DR反映了制備堅果油微乳時表面活性劑的最少用量,因此,以DR為指標,初步篩選最佳的堅果油微乳體系的表面活性劑,結(jié)果見表2。對于Tween系列表面活性劑,隨著疏水鏈的長度變短,HLB值增大,越不利于微乳的形成,這與梁蓉等[21]的研究結(jié)果一致。表面活性劑的HLB值決定微乳的類型,HLB在3~8的表面活性劑可制備W/O型微乳,HLB在8~18的表面活性劑可制備O/W型微乳[24]??紤]到單一的表面活性劑不能很好的形成微乳或形成的微乳不穩(wěn)定,因此在單一乳化劑初選結(jié)果的基礎(chǔ)上,通過考察成乳效果和DR值。試驗結(jié)果表明,選取TW-60和PEG-40作為復合表面活性劑較為合適。

    2.2? 單因素試驗結(jié)果

    2.2.1? 表面活性劑配比的影響? 將TW-60/PEG- 40分別按質(zhì)量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5混合作為混合表面活性劑,按照1.2方法制備微乳,繪制出擬三元相圖,計算SME,得到的結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,TW-60與PEG-40在質(zhì)量比3∶1條件下成乳區(qū)域最大,SME顯著高于其他配比,這可能是因為該配比與澳洲堅果油乳化所需的HLB值最接近。所以響應(yīng)面試驗中選擇TW-60/PEG-40質(zhì)量比3∶1為中心點進行優(yōu)化。

    2.2.2? 助表面活性劑含量的影響? 將PEG400/堅果油分別按質(zhì)量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1及5∶1混合為混合油相,按照1.2.1方法制備微乳,繪制出偽三元相圖,計算SME。由圖3可知,隨著PEG400含量的增加,SME明顯增大,當PEG400與堅果油質(zhì)量比為3∶1時,SME達到最大,這是因為隨著助表面活性劑含量的增加,降低了形成微乳所需的表面活性劑含量[16];繼續(xù)增加助表面活性劑,SME反而減小,這可能與形成的微乳體系內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)。在最佳條件下,助表面活性劑正好完全鑲嵌到表面活性劑中,此時形成的微乳結(jié)構(gòu)中增溶空間最大,載油量最大。但是當助表面活性劑增加至過量時,可與表面活性劑的極性端締合使混合膜變得松散,微乳區(qū)面積反而減小,而且會導致混合膜強度降低,影響微乳穩(wěn)定性[19-20]。因此,綜合考慮響應(yīng)面試驗中PEG400/堅果油質(zhì)量比為3∶1為中心點進行優(yōu)化較為合適。

    2.2.3? 制備溫度的影響? 制備溫度對微乳區(qū)面積的影響如圖4所示。圖4反映了在不同溫度條件下所制備微乳的SME的變化趨勢。當溫度為90 ℃時SME最大,與60 ℃條件下所形成SME差異不顯著,溫度升高對于提升微乳區(qū)的面積并不十分明顯,但隨著溫度的進一步升高,由于澳洲堅果油富含不飽和脂肪酸,可能導致微乳中的澳洲堅果油加速氧化,引起變質(zhì)。因此,綜合考慮選擇微乳的制備溫度60 ℃為中心點進行優(yōu)化較為合適。

    2.3? 響應(yīng)面試驗及結(jié)果分析

    2.3.1? 響應(yīng)面法確定堅果油微乳較佳配方? 將TW-60與PEG-40質(zhì)量比A(n)、PEG400與堅果油質(zhì)量比B(k)和制備溫度C(t)經(jīng)過如下變換:A=(n-3)/2,B=(k-3)/1,C=(t-60)/15后作為自變量,以試驗中繪制偽三元相圖所計算得到的微乳區(qū)面積SME(%)為響應(yīng)值,響應(yīng)面分析實驗方案及結(jié)果見表3,回歸方程方差分析結(jié)果見表4。采用Design-Expert 8.0.6軟件,對表3中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得出以微乳區(qū)面積SME(%)為目標函數(shù)的二次回歸方程:

    表4回歸統(tǒng)計分析結(jié)果表明:選取的三個因素對SME的影響順序為:PEG400與堅果油質(zhì)量比(B)>制備溫度(C)>TW-60與PEG-40質(zhì)量比(A)。模型的F=13.23,p=0.0013<0.01,表明實驗的二次模型是極顯著的,具有統(tǒng)計學意義。失擬項p值=0.0598>0.05,說明模型不失擬,回歸決定系數(shù)R2=0.9445,校正決定系數(shù)R2Adj=0.8731,說明該二次多項模型可以解釋87.31%的響應(yīng)值的變化,模型能夠充分擬合實驗數(shù)據(jù)。因此,可以利用該回歸方程對SME的變化進行分析。模型中二次項A2、B2對SME的影響極顯著(p<0.01),二次項C2對SME的影響為顯著(p<0.05);一次項B對SME的影響極顯著(p<0.01),一次項A、C和交互項AB、AC、BC對SME的影響均不顯著(p>0.05),無統(tǒng)計學意義。

    明該因素對SME的影響越大,相應(yīng)表現(xiàn)為SME數(shù)值變化的大小。由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。從圖5能夠看出影響SME最大的因素是B,達到極顯著水平,其次是C和A,表4回歸分析結(jié)果也與此相吻合。

    2.3.2? 驗證試驗? 通過Design Expert軟件分析確定的微乳液最佳制備工藝為TW-60與PEG-40質(zhì)量比2.51、PEG400與堅果油質(zhì)量比3.62、制備溫度63.8 ℃,此條件下SME的理論預測值為14.13%??紤]到實際操作可行性,將工藝條件調(diào)整為TW-60與PEG-40質(zhì)量比2.5、PEG400與堅果油質(zhì)量比3.5、制備溫度60 ℃,按1.2.1的方法繪制偽三元相圖如圖6所示。試驗得到SME為(13.61±0.42)%,模型預測值為13.74%,與理論預測值相差不大,說明模型可靠,擬合度好,可用于澳洲堅果油微乳液制備工藝參數(shù)優(yōu)化和回歸分析。優(yōu)化得到的微乳液SME數(shù)值與梁蓉等[21]制備的丁香油微乳相當。

    2.4? 微乳類型鑒定結(jié)果

    如圖7所示,在微乳液表面滴加等量染液后觀察,藍色亞甲基藍在微乳中的擴散速度明顯快于紅色蘇丹紅Ⅲ的擴散速度,顏色逐漸擴散到微乳液中表明所制備的澳洲堅果油微乳為水包油(O/W)型。圖8為不同配方微乳樣品,從2個配方樣品外觀可以看出澳洲堅果油微乳液基本為澄清透明的液體。

    采用上述試驗方法制備的微乳劑進行形態(tài)觀察,激光共聚焦顯微鏡觀察的形態(tài)見圖9所示,由圖可知澳洲堅果油微乳成球形,粒徑較小,分布均一;通過透射電鏡觀察觀察微乳形態(tài)見圖10所示,由圖可知澳洲堅果油微乳形態(tài)規(guī)整,電鏡左滴加亞甲基藍,右滴加蘇丹紅Ⅲ。

    2.5? 堅果油微乳的粒徑分布及稀釋、貯藏穩(wěn)定性

    為探究澳洲堅果油經(jīng)微乳包埋后的穩(wěn)定性情況,分別選擇圖6中O/W型微乳中心區(qū)域位置的兩條無限稀釋線上靠近中心的兩個配方點:樣品一:混合表面活性劑(TW-60∶PEG-40=2.5∶1):混合油(PEG400:堅果油=3.5∶1):水=12∶3∶35(質(zhì)量比);樣品二為:混合表面活性劑(TW-60∶PEG-40=2.5∶1):混合油(PEG400∶堅果油=3.5∶1):水=21∶9∶56(質(zhì)量比),如圖8所示,通過粒徑測定,評估其穩(wěn)定性。

    粒徑大小和分布是微乳性質(zhì)最主要的評價指標,澳洲堅果油微乳的粒徑分布見圖11,澳洲堅果油微乳的粒徑分布較為理想,平均粒徑為15.23 nm。由表5可知,澳洲堅果油微乳在經(jīng)過10倍、100倍水相稀釋后,微乳粒徑變化不大,這表明微乳在稀釋過程中粒徑能基本保持恒定,而且微乳稀釋前后的多分散指數(shù)PDI(Polydispersity index)值均較小,說明2種配方制備的微乳稀釋穩(wěn)定性較好。PDI可反應(yīng)堅果油微乳中粒子的分散寬度,通過粒徑分析儀測定(通過儀器自帶軟件按照國際化標準ISO 13321計算得到)。PDI值在0.1~0.3之間則表示樣品是單分散體系,PDI值越大,體系越復雜,表5中測定的PDI值表明澳洲堅果油微乳是單分散體系。儲藏穩(wěn)定性也是影響微乳應(yīng)用的重要因素,試驗通過測定乳液粒徑隨時間的變化情況來表征。由表5可知。在儲藏60 d內(nèi),澳洲堅果微乳粒徑變化不大,無明顯差異,PDI值在儲藏過程中也無明顯變化,表明2種微乳均能保持良好的貯藏穩(wěn)定性。

    3? 討論

    本研究采用轉(zhuǎn)相乳化法制備微乳液,通過繪制偽三元相圖,以及單因素試驗和Box-Behnken試驗成功構(gòu)建澳洲堅果油O/W微乳體系,并確定了微乳較佳配方:TW-60與PEG-40質(zhì)量比2.5、PEG400與堅果油質(zhì)量比3.5、制備溫度60 ℃,此條件下形成微乳液的微乳區(qū)面積可達13.61%,在DR值為6∶4條件下,澳洲堅果油最大載量占比達到25.0%,并可加水無限稀釋。作為一種經(jīng)濟價值較高的油脂,該比例已經(jīng)足夠?qū)ζ溥M一步開發(fā)應(yīng)用。通過考察微乳區(qū)中心區(qū)域的兩個配方樣品在長期儲存、大量稀釋過程中粒徑大小的變化情況,結(jié)果表明兩種微乳粒徑變化不大,表明其穩(wěn)定性良好。另外,儲藏試驗表明粒徑較大的澳洲堅果油微乳至少可貯藏100 d,稀釋前后的多分散指數(shù)PDI值均較小,也說明制備的澳洲堅果油微乳液性質(zhì)穩(wěn)定。

    澳洲堅果油的生物活性功能被越來越多的研究結(jié)果所證實,作為一種保健價值較高的功能性植物油脂,市面上關(guān)于澳洲堅果油的加工產(chǎn)品以及以往的科學研究僅限于制作堅果油微膠囊、粉末油脂等方面,雖克服了澳洲堅果油易被氧化的不足,但產(chǎn)品為固體狀態(tài),且工業(yè)化生產(chǎn)復雜,大大限制了在食品中的進一步應(yīng)用。本研究提供了一種切實可行的方案,將澳洲堅果油制備成澄清透明、水包油型的食品級微乳液,不但克了服其易氧化和疏水特性,且研究結(jié)果表明該微乳液穩(wěn)定性良好,表現(xiàn)出熱力學穩(wěn)定、粒徑小、增容性強等優(yōu)點。另外,整個工藝過程較為簡單,不需特殊設(shè)備即可大批量生產(chǎn),在功能食品以及化妝品領(lǐng)域應(yīng)用前景良好。

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