芒果果實bHLH家族轉錄因子的生物信息學分析

鄭斌 文定青 武紅霞 鄒明宏 劉恒

摘? 要? bHLH家族作為植物中較大的轉錄因子家族之一，在真核生物生長發(fā)育調控中具有重要作用。本研究基于芒果果實轉錄組數據，利用生物信息學方法鑒定出87個bHLH家族蛋白，其中酸性蛋白所占比例較大，大部分為不穩(wěn)定蛋白，且均為不含信號肽的親水性蛋白，除CL10714.Contig1為膜結合轉錄因子外，其余均不含跨膜結構。芒果bHLH蛋白結構域有多個氨基酸位點保守性較高，87個芒果bHLH蛋白中73個（83.91%）具有E-box結合功能。GO分析發(fā)現芒果bHLH蛋白共注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能3大類功能的17個亞類。進化樹分析發(fā)現芒果bHLH蛋白與擬南芥有較高的保守性，并基于進化樹對部分bHLH蛋白的功能進行了預測。本研究結果將為下一步芒果bHLH蛋白的功能研究奠定基礎。

關鍵詞? 芒果;bHLH家族;轉錄因子;生物信息學

中圖分類號? S667.7? ? ?文獻標識碼? A

堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic Helix-Loop-Helix， bHLH）轉錄因子為真核生物蛋白中的一個大家族[1]，在生物的生長發(fā)育調控中起著極為重要的作用。bHLH轉錄因子于1989年首次在動物中發(fā)現，因含有bHLH結構域而得名[2]。bHLH結構域由大約60個氨基酸組成，分為堿性氨基酸區(qū)域（basic）和α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)（HLH），堿性氨基酸區(qū)位于bHLH結構域的N端，長度約為15個氨基酸，主要負責與DNA順式元件結合，HLH區(qū)位于該結構域的C-端，由大約40個氨基酸組成，具有形成二聚體的特性[2-4]。

植物中bHLH轉錄因子是僅次于MYB的第二大轉錄因子家族[5]，其參與調控抗逆、器官發(fā)育、激素響應及代謝物合成等多個生物學進程[6]。與對照相比，擬南芥中過表達bHLH122基因的株系對干旱、NaCl和滲透脅迫的抗性增強[7];Jiang等[8]發(fā)現bHLH轉錄因子參與了黃瓜果實長度的調控;在擬南芥中，bHLH基因BEE1、BEE2和BEE3參與對油菜素內酯的響應，且這3個基因在油菜素內酯的信號傳導中功能冗余[9];MdbHLH33參與調控蘋果花色素苷的生物合成[10]。

基于高通量測序及生物信息學分析技術，人們已對一些植物的bHLH基因家族進行了挖掘、比較分析和功能預測，并對部分bHLH基因進行了功能分析?；诨蚪M信息，Geng等[11]在甜橙中發(fā)現56個bHLH轉錄因子，其中CsbHLH18通過調控抗氧化基因調節(jié)植株耐寒性及活性氧平衡。芒果素有“熱帶果王”之美譽，含有豐富的糖類、蛋白質、維生素、類胡蘿卜素和鈣質等營養(yǎng)成分，在我國主要分布在海南、廣西、云南、四川、廣東和福建等地，已成為我國熱區(qū)農業(yè)的支柱產業(yè)[12]，但目前關于芒果bHLH轉錄因子的研究還鮮有報道。為此，本研究基于芒果果實轉錄組測序結果，利用生物信息學手段對bHLH家族基因進行鑒定和分析，為進一步探究芒果bHLH轉錄因子的功能奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

芒果蛋白序列來源于構建的轉錄組數據庫（GenBank accession SRP035450）。擬南芥bHLH家族氨基酸序列下載于擬南芥信息資源（TAIR）數據庫（http：//www.arabidopsis.org/）。

1.2? 方法

1.2.1? 芒果bHLH家族蛋白的鑒定? 從Pfam 31.0[13]數據庫（http：//pfam.xfam.org/）下載HLH結構域種子文件PF00010和PF14215，利用HMMER 3.1b2[14]軟件分別構建Profile HMM（數值表格型隱馬可夫模型），基于Profile HMM分別檢索芒果轉錄組蛋白數據庫并對檢索結果進行整合去冗余，得到候選蛋白。將候選蛋白用SMART[15]（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析HLH結構域，同時用NCBI blast（https：//blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和植物轉錄因子數據庫[16]（PlantTFDB）（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）進行進一步分析鑒定，篩選出具有全長氨基酸序列的芒果bHLH轉錄因子。

1.2.2? 芒果bHLH家族蛋白生物信息學分析? 基于篩選鑒定的芒果bHLH家族蛋白，利用在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對其進行理化性質分析，并用在線軟件SOPMA[17]（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_ sopma.html）分析其二級結構，信號肽的預測應用SignalP 4.1 Server[18]（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進行分析，最后采用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件完成跨膜結構分析。

1.2.3? 芒果bHLH家族蛋白結構域分析? 使用BioEdit軟件對芒果bHLH家族蛋白結構域進行比對，將比對結果用在線軟件WebLogo 3（http：//weblogo.threeplusone.com/cre ate.cgi）分析結構域序列標簽。

1.2.4? 芒果bHLH家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構建及基序分析? 利用MEGA 6.0軟件內置的Clustal W程序對芒果bHLH家族蛋白的氨基酸序列進行比對分析，將比對結果采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，選用Poisson模型，并進行自舉評估（Bootstrap），重復次數為1000次，缺失值處理方式為配對狀態(tài)刪除（pairwise deletion），其他參數使用默認值[19]。運用MEME 4.11.02程序[20]分析芒果bHLH家族蛋白的基序，設定基序寬度為6～50，基序數量為5，其余參數為默認值。

1.2.5? 芒果bHLH家族蛋白GO分析? 首先使用Blast2GO 4.0軟件[21]對芒果bHLH家族蛋白序列進行GO（gene ontology）注釋，然后用在線軟件WEGO[22]（http：//wego.genomics.org.cn/cgi-bin/ wego/index.pl）繪制GO功能分類圖。

1.2.6? 芒果和擬南芥bHLH蛋白進化樹構建? 使用MEGA 6.0軟件采用最大似然法將芒果bHLH蛋白和擬南芥bHLH蛋白共同構建進化樹。

2? 結果與分析

2.1? 芒果bHLH家族成員的獲得

基于從Pfam 31.0數據庫下載的種子文件PF00010和PF14215，使用HMMER 3.1b2軟件從芒果轉錄組49 117個蛋白序列中分別篩選出211個和86個候選蛋白序列，逐個進行結構域及同源比對分析，去除重復及非全長氨基酸序列，共獲得87個芒果bHLH家族蛋白序列（表1），其中最小的bHLH蛋白含89個氨基酸，最大的bHLH蛋白含944個氨基酸。

2.2? 芒果bHLH家族蛋白特性分析

對芒果bHLH家族蛋白進一步進行生物信息學分析（表1），理化性質分析發(fā)現：87個芒果bHLH家族蛋白的相對分子量在10.17～102.47 ku之間，其中含61個酸性蛋白（理論等電點<7）和26個堿性蛋白（理論等電點>7）;不穩(wěn)定指數（Ⅱ）分析發(fā)現除Unigene21025和CL12 02.Contig3為穩(wěn)定蛋白外（Ⅱ<40），其余均為不穩(wěn)定蛋白（Ⅱ>40）;平均疏水指數均小于0，為親水性蛋白。二級結構分析發(fā)現：芒果bHLH家族蛋白中無規(guī)卷曲和α-螺旋所占比例較大，其中50個為無規(guī)卷曲所占比例最大，36個為α-螺旋所占比例最大，CL5018.Contig2二級結構中α-螺旋和無規(guī)卷曲所占比例一致。87個bHLH家族蛋白均不含信號肽?？缒そY構分析發(fā)現CL10714.Contig1含跨膜結構，為膜結合轉錄因子，其余bHLH蛋白均不含跨膜結構。

2.3? 芒果bHLH蛋白結構域分析及分類

使用BioEdit對87個芒果bHLH蛋白的結構域進行比對，并用WebLogo 3獲得芒果bHLH蛋白的結構域序列標簽（圖1）。分析發(fā)現，在芒果bHLH結構域的2個α-螺旋區(qū)內，23和54位點均為疏水性氨基酸亮氨酸（L），100%的20、44和51位點，98.85%的16位點以及97.70%的27位點為疏水性氨基酸（A、F、I、L、M、P、V、W或Y），而這些疏水性氨基酸對bHLH的蛋白二級結構的穩(wěn)定性起著關鍵作用[23]。

在bHLH結構域的堿性區(qū)內，有多個關鍵位點用于識別并結合DNA特定堿基序列，其中9位點的谷氨酸（E）用于與DNA雙螺旋結構的大溝結合[23]，分析發(fā)現，73個（83.91%）芒果bHLH結構域的9位點為谷氨酸（E），其中72個在9位點為谷氨酸（E）且12位點為精氨酸（R），而且研究發(fā)現具有9位點為E且12位點為R結構的bHLH蛋白具有識別并結合E-box序列（CANNTG）的功能[24]，57個（65.52%）bHLH蛋白結構域在5位點為組氨酸（H）或賴氨酸（K）、9位點為谷氨酸（E）且13位點為精氨酸（R），而在植物中該結構被證實用于識別并結合G-box[25]。在14個9位點不是谷氨酸（E）的bHLH結構域中，有3個bHLH結構域的堿性區(qū)內含5個及以上堿性氨基酸（R、K或H），這3個bHLH蛋白可能在非E-box序列處與DNA結合[4]。11個bHLH結構域9位點不是谷氨酸（E）且堿性區(qū)內含5個以下堿性氨基酸（R、K或H），該類bHLH蛋白不具有結合DNA功能[26]。

2.4? 芒果bHLH家族蛋白進化樹及基序分析

通過MEGA 6.0軟件構建芒果bHLH家族蛋白的系統(tǒng)進化樹。由圖2可知，在進化樹中，相同類型的bHLH蛋白聚在一起，且相近分支的bHLH序列長度及結構域位置相近。

3? 討論

植物bHLH蛋白參與抗逆、生長發(fā)育、生物合成及信號傳導等生理生化過程[35]?；谏镄畔W分析技術，目前已從一些植物如擬南芥[36]、水稻[37]、人參[38]、西瓜[39]、茶樹[40]、葡萄[41]、蘋果[42]等分別鑒定出162、167、169、96、120、110、175個bHLH蛋白。

本研究基于芒果果實轉錄組數據，鑒定出87個bHLH家族蛋白，其中酸性蛋白所占比例較大，大部分為不穩(wěn)定蛋白，且均為不含信號肽的親水性蛋白，此現象與‘短柄櫻桃[43]等多種植物的bHLH家族蛋白相似。除CL10714.Contig1為膜結合轉錄因子外，其余bHLH蛋白均不含跨膜結構，推測CL10714.Contig1與芒果對環(huán)境的脅迫響應有關[44]。大部分芒果bHLH家族蛋白二級結構中無規(guī)卷曲所占比例最大，該結果與云南紅皮梨bHLH轉錄因子一致[45]。

芒果bHLH蛋白結構域有多個氨基酸位點保守性較高，且保守位點與西瓜[39]和蓮[46]bHLH蛋白的分析結果相似。87個芒果bHLH蛋白中的73個（83.91%）具有E-box結合功能，57個（65.52%）具有G-box結合功能，該結果與擬南芥（60.54%）和水稻（56.89%）[37]的分析結果相似。

進化樹上相近分枝的芒果bHLH的基序組成相同，序列長度及結構域位置相近，與擬南芥bHLH的分析結果相似[27]。

芒果bHLH蛋白共注釋到GO分類中生物學過程、細胞組分和分子功能3大類功能的17個亞類，其中56.32% bHLH蛋白注釋到結合功能。

對芒果和擬南芥bHLH蛋白共同構建的進化樹分析發(fā)現，芒果bHLH蛋白與擬南芥有較高的保守性，大部分芒果bHLH蛋白與擬南芥不同亞組的bHLH蛋白聚在一起，推測芒果bHLH蛋白與相近的擬南芥bHLH蛋白具有相似的功能，該分析將為下一步芒果bHLH蛋白的功能分析提供參考?；诖朔椒ǎ珻hen等[47]發(fā)現與擬南芥AtbHLH112同源的水稻OsbHLH068在參與鹽脅迫響應時與AtbHLH112功能一致，參與花期調控時與AtbHLH112功能相反。

bHLH蛋白參與植物的多種生命活動，本研究從芒果轉錄組數據中鑒定87個bHLH家族蛋白，為今后芒果bHLH家族蛋白的研究提供了基礎。由于轉錄組數據的局限性，所鑒定的僅為芒果bHLH家族的部分蛋白序列，因此，芒果bHLH家族蛋白還有待進一步挖掘和研究。本研究僅對部分芒果bHLH蛋白進行了功能預測，其具體功能有待進一步驗證。

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