建蘭花葉病毒RT-LAMP檢測方法的建立

樊榮輝 黃敏玲 鐘淮欽 羅遠(yuǎn)華

摘? 要? 建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）是侵染蘭花的主要病毒，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值，建立快速、靈敏的檢測方法顯得尤為重要。根據(jù)CyMV的外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)4對特異性引物，經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立該病毒的RT-LAMP 檢測方法，并進(jìn)行LAMP檢測的特異性、敏感性檢測。該方法能特異擴(kuò)增CyMV，與其他4種病毒（齒蘭環(huán)斑病毒、菜豆黃花葉病毒、黃瓜花葉病毒和小蒼蘭花葉病毒）不發(fā)生反應(yīng);靈敏度為RT-PCR的10倍。田間檢測20份樣品中，RT-LAMP和RT-PCR檢測結(jié)果一致，檢出率為60%。在產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR GreenⅠ，直接用肉眼觀察就可判斷樣品是否感染CyMV，可省去電泳分析的時(shí)間。針對CyMV建立的RT-LAMP方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、快速等特點(diǎn)，適用于在進(jìn)境檢疫及種苗繁育過程中的檢測鑒定。

關(guān)鍵詞? 建蘭花葉病毒;RT-LAMP;檢測

中圖分類號? S436.8? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）是蘭花中最嚴(yán)重的病毒之一，洋蘭（蝴蝶蘭、石斛蘭、文心蘭等）主要由CyMV病毒單獨(dú)侵染為主[1]。蘭花受CyMV侵染后出現(xiàn)花葉、畸形、壞死及花瓣變色等癥狀，導(dǎo)致品質(zhì)下降，影響觀賞價(jià)值，制約蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2-3]。目前尚缺乏有效防治建蘭花葉病毒的藥劑，最有效方法是培育無毒種苗，而這就需要對種苗進(jìn)行病毒檢測及鑒定。因此，建立快速、靈敏的檢測技術(shù)尤為重要。目前，對CyMV的檢測主要集中在酶聯(lián)免疫法（ELISA）和RT-PCR技術(shù)。2006年，Lee等[4]建立了CyMV與其他病毒的多重RT-PCR檢測技術(shù)，2008年，Lee等[5]建立了CyMV的抗血清技術(shù)。這些技術(shù)能有效檢測CyMV，并對后續(xù)新技術(shù)出現(xiàn)提供借鑒。酶聯(lián)免疫法是目前較常用的一種方法[6]，但也存在靈敏度不高、易出現(xiàn)假陽性等缺點(diǎn)。PCR技術(shù)已成為常規(guī)檢測手段[7]，但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求比較高，不利于向基層檢驗(yàn)部門推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Loop-me diated isothermal amplification，LAMP）應(yīng)用4條特異性引物，通過Bst DNA聚合酶，在水浴鍋中對靶基因進(jìn)行的一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[8]，該技術(shù)具有擴(kuò)增特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作快速簡便、檢測簡單等特點(diǎn)，擺脫了對PCR儀等昂貴儀器的依賴[9-11]，在基層的檢測更加方便。本研究對CyMV的保守外殼蛋白（CP）基因設(shè)計(jì)4條特異性引物，并對其靈敏性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證，建立了可特異檢測該病毒的RT-LAMP檢測方法，以期為蘭花種苗篩選提供可靠簡便的檢測方法，也利于基層檢疫部門進(jìn)行進(jìn)出口檢測。

1? 材料與方法

1.1? 材料

感染了建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus， CyMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、小蒼蘭花葉病毒（Freesia mosaic virus，F(xiàn)reMV）、齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）的陽性樣品及健康對照樣品的葉片均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

熒光染料SYBR GreenⅠ購自北京鼎國公司;Bst聚合酶、MgSO4購自New England Biolabs（美國）;EcoR I、PMD18-T載體、JOM109 感受態(tài)細(xì)胞均購自TaKaRa;甜菜堿購自Sigma（美國）。

1.2? 方法

1.2.1? RT-LAMP 體系的建立? 取感染病毒的葉片，按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）方法提取樣品的總RNA。

根據(jù)GenBank公布的CyMV較保守的CP基因序列為靶標(biāo)基因（AY429021、HQ644132、GU295168、AF016914、EU672821和GQ507023），設(shè)計(jì)得到6區(qū)域的4條特異性引物，其中F3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物（表1）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

反應(yīng)體系（25 μL）：10×Bst buffer 2.5 μL、 25 mmol/L MgSO4 4 μL、5 mmol/L Betaine 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL 、8 U/μL Bst聚合酶1 μL、20 μmol/L FIP 2 μL、20 μmol/L BIP 2 μL、10 μmol/L F3 0.5 μL、10 μmol/L B3 0.5 μL、 ddH2O 2 μL、cDNA 2.5 μL。反應(yīng)條件為：65 ℃、60 min，80 ℃、5 min。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析;同時(shí)產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ，目視觀察結(jié)果。

1.2.2? RT-LAMP 產(chǎn)物酶切鑒定? 為了進(jìn)一步驗(yàn)證LAMP擴(kuò)增的正確性，在設(shè)計(jì)LAMP引物時(shí)加入了EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（gaattc）。將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物電泳后，梯形條帶進(jìn)行膠回收，再用EcoR Ⅰ37 ℃酶切過夜，連接于PMD18-T載體上，用JOM109感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，測序。

1.2.3? 特異性和靈敏度驗(yàn)證? 對感染ORSV、FreMV、CMV、BYMV、CyMV的陽性樣品，分別提取總RNA，應(yīng)用RT-LAMP檢測，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

對感染CyMV陽性樣品的總RNA，進(jìn)行10、102、103、104、105倍梯度稀釋，分別進(jìn)行RT-LAMP 和 RT-PCR靈敏度檢測。

運(yùn)用RT-LAMP和RT-PCR技術(shù)，對田間隨機(jī)采集的10份建蘭和10份文心蘭樣品進(jìn)行特異性檢測和驗(yàn)證。

2? 結(jié)果與分析

2.1? RT-LAMP

通過反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了能擴(kuò)增CyMV的RT-LAMP 反應(yīng)體系（圖1），RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物有階梯狀的條帶，陰性對照未發(fā)現(xiàn)條帶;加入 SYBR GreenⅠ，混勻，RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物為黃綠色，陰性對照為橙色。

2.2? RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切驗(yàn)證

將LAMP產(chǎn)物膠回收后，用EcoRⅠ酶切如圖2，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化測序，最終得出，酶切出的片段為目標(biāo)基因的F2-B2的序列，包括酶切堿基在內(nèi)大小為165 bp。證明該體系擴(kuò)增產(chǎn)物為靶基因。

2.3? 特異性驗(yàn)證

以分別感染ORSV、BYMV、FreMV、CMV和CyMV的樣品總RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP 擴(kuò)增。如圖3所示，只有CyMV有梯狀條帶，檢測結(jié)果為陽性，其他不產(chǎn)生條帶，說明建立的檢測體系對CyMV檢測有較好特異性。

2.4? 靈敏度檢測

對不同濃度稀釋后的RNA，分別進(jìn)行 RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，RT-LAMP在稀釋1000倍時(shí)，仍能檢測出CyMV，而RT-PCR在稀釋100倍還能檢測出CyMV，稀釋1000倍時(shí)，未檢出（圖4），表明RT-LAMP檢測CyMV的靈敏度是RT-PCR的10倍。

2.5? 田間樣品測定

隨機(jī)采取建蘭和文心蘭樣品各10份，分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，兩者檢測結(jié)果一致，建蘭有4份樣品呈陽性，文心蘭有8份樣品呈陽性（表2），表明RT-LAMP檢測技術(shù)能應(yīng)用于田間樣品。

3? 討論

蘭花是中國四大名花之一，代表高貴、典雅，具有極高的觀賞和收藏價(jià)值。但當(dāng)病毒病侵染時(shí)，植株會出現(xiàn)畸形、壞死，從而造成品質(zhì)下降，這是制約蘭花大規(guī)模生產(chǎn)的重要因子。為滿足消費(fèi)需求，培育無病毒苗是防止病毒病的重要措施，因此，建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法，對阻止病毒病的傳播有良好作用;或?qū)γ摱久邕M(jìn)行檢測，從根源上預(yù)防病毒病也具有重要意義。本試驗(yàn)針對建蘭花葉病毒建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有擴(kuò)增快速高效、特異性好、操作簡便、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，可以針對性地對蘭花脫毒種苗進(jìn)行檢測，從種源遏制病毒病的發(fā)生。本研究技術(shù)具有較高的應(yīng)用價(jià)值，在基層和現(xiàn)場檢測中有很好的應(yīng)用前景。

目前，病毒檢測的常用方法是PCR和ELISA技術(shù)，均且具有較好的檢測效果，但也存在耗時(shí)長，成本高的特點(diǎn)，不太適用于基層檢測。與常規(guī)PCR方法相比，本研究所建立的LAMP技術(shù)，在保持PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，不需特殊儀器，成本低，且由于不需要熱循環(huán)，整個(gè)過程可以在60 min內(nèi)完成，更加省時(shí)，檢測結(jié)果若采用加入SYBR GreenⅠ目測的方式，檢測更快捷方便。因此該方法特別適合在基層中應(yīng)用。

LAMP 技術(shù)使用4～6條引物，會進(jìn)一步增強(qiáng)反應(yīng)的特異性[12-13]。引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，也較復(fù)雜和困難，除要遵循一般引物設(shè)計(jì)原則外，還有LAMP 引物設(shè)計(jì)自身要注意的事項(xiàng)[14]，特別是對于病毒多個(gè)生理小種間保守的CP基因差異明顯或GC含量較高序列設(shè)計(jì)更加困難[15]。本研究針對建蘭花葉病毒CP基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)驗(yàn)證該引物的特異性良好。同時(shí)，本研究建立的檢測CyMV的RT-LAMP方法靈敏度較高，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍，對于病毒含量很少的脫毒苗的快速檢測方面有一定的優(yōu)勢。LAMP方法靈敏度高，容易出現(xiàn)假陽性，因此本研究采用在RT-LAMP 反應(yīng)管蓋上滴加SYBR green I染色劑，待反應(yīng)結(jié)束后在不開蓋的情況下直接使染色劑與擴(kuò)增產(chǎn)物混合，以此減少反復(fù)開蓋而造成的污染問題。

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