果酒酵母和異常維克漢姆酵母混菌發(fā)酵復合水果的風味物質特征

劉叢竹 郭波布 安琪 等

摘要 [目的]以麥芽汁、火龍果、葡萄、菠蘿組合的復合果汁，通過果酒酵母和異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）混菌發(fā)酵得到一種具有紅酒風味特征的復合果酒。[方法]以紅酒風味指標為標準，測定發(fā)酵酒的酒精度、還原糖、總酸等理化指標，以及乙酸乙酯、高級醇、有機酸等主要風味物質，并進行感官評價。[結果]復合果酒的主要風味特征指標符合紅酒風味標準，酒精度為10.5%（體積比），混菌發(fā)酵比果酒酵母單菌發(fā)酵更快，酒中乙酸乙酯含量提高了32.10%，達50.55 mg/L，高級醇含量提高到251.09 mg/L，總有機酸降低到4.94 g/L。[結論]通過混菌發(fā)酵復合果汁獲得具有紅酒風味特征的復合果酒，這為南方水果的復合果酒釀造提供了新思路。

關鍵詞 混菌發(fā)酵;異常維克漢姆酵母;復合果酒;風味物質

中圖分類號 TS262.7文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0162-03

Abstract [Objective]A composite fruit juice composed of wort， dragon fruit， grape and pineapple was fermented by fruit wine yeast and Wickerhamomyces anomalus yeast to obtain a composite fruit wine with red wine flavor characteristics. [Method]With the red wine flavor index as the standard， the physical and chemical indicators such as alcohol content， reducing sugar and total acid of fermented wine， as well as main flavor substances such as ethyl acetate， higher alcohol and organic acid were determined，sensory evaluation was carried out. [Result]The main flavor characteristics of compound wine were in line with the red wine flavor standard. The alcohol content was 10.5%（volume ratio）.The fermentation of mixed bacteria was faster than the single bacteria fermentation of wine yeast， and the ethyl acetate content in wine increased by 32.10% to 50.55 mg/L. The higher alcohol content was increased to 251.09 mg/L， and the total organic acid was reduced to 4.94 g/L. [Conclusion]The composite fruit juice with red wine flavor characteristics was obtained by mixed fermentation of mixed fruit juice， which provided feasibility for the composite fruit wine brewing by southern fruits.

Key words Mixed fermentation;Wickerhamomyces anomalus;Composite fruit wine;Flavor substance

復合果酒通常是2種或2種以上的水果按一定的比例混合，經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵釀造出的一種新型果酒。近年來，對非釀酒酵母的研究表明，這些酵母對釀酒過程有很大影響，能增強和改善葡萄酒的感官特性[1]。異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）作為非釀酒酵母，在芒果酒等果酒、白酒及面包發(fā)酵等各方面都有應用，且效果俱佳[2]。You等[3]從宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)分離了大量功能釀酒酵母，其中1株異常維克漢姆酵母菌體現(xiàn)了很好的產(chǎn)酯能力。Martínez等[4]將麥芽汁與柿子汁以1∶1比例混合，經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后的口感較佳，風味物質含量特征都較好。筆者用麥芽汁代替部分果汁，節(jié)省原材料費用的同時可以為酵母提供豐富的碳氮源，用紅心火龍果增添果酒顏色，用菠蘿增香，果酒酵母和異常維克漢姆酵母混菌發(fā)酵得到一種符合紅酒風味標準的新型復合果酒，并就異常維克漢姆酵母菌對復合果酒的風味物質特征影響做了定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。實驗室分離和鑒定的異常維克漢姆酵母;果酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與發(fā)酵液。YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L、酵母浸膏 10 g/L、蛋白胨 20 g/L。

復合果汁的制備：將新鮮洗凈的葡萄、紅心火龍果、菠蘿果肉分別榨汁。將22 °P的麥芽汁[5]、葡萄汁、火龍果汁、菠蘿汁按3∶1∶1∶1混合。用白砂糖、食用酒石酸調糖度為200 g/L，pH 3.4。

1.2 方法

1.2.1 菌液活化。將2種酵母菌接種至50 mL YPD液體培養(yǎng)基中活化，再轉接至YPD固態(tài)培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)至形成單菌落，然后挑取單菌落接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫擴培2 d，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.2.2.1 確定異常維克漢姆酵母菌接種比例。將果酒酵母以1×106 CFU/mL接種于復合果汁中，再分別接種0、4×104、2×105、4×105、1×106 CFU/mL的異常維克漢姆酵母，22 ℃靜置發(fā)酵7 d，然后測定發(fā)酵酒中的酒精度和乙酸乙酯含量。

1.2.2.2 發(fā)酵時間的優(yōu)化。將復合果汁接種1×106 CFU/mL果酒酵母（純菌）和同時接種1×106 CFU/mL果酒酵母、2×105 CFU/mL異常維克漢姆酵母菌（混菌），22 ℃靜置發(fā)酵7 d，每隔24 h取樣，測定還原糖。

1.2.2.3 優(yōu)化條件下發(fā)酵復合果酒及其成分測定。將復合果汁接種1×106 CFU/mL果酒酵母（純菌）和同時接種1×106 CFU/mL果酒酵母、2×105 CFU/mL的異常維克漢姆酵母菌（混菌），22 ℃靜置發(fā)酵7 d，然后測定發(fā)酵酒中高級醇、有機酸和滴定酸含量，并進行感官評價。

1.2.3 釀造果酒的理化指標檢測。

1.2.3.1 酒精度。通過GB 15038—2006-T，采用酒精計法測定發(fā)酵液的酒精度[6]。

1.2.3.2 滴定酸。通過GB 15038—2006-T，采用酸堿滴定法（以酒石酸計）測定發(fā)酵液的滴定酸[6]。

1.2.3.3 還原糖。通過GB 15038—2006-T，采用DNS測還原糖法測定發(fā)酵液的還原糖含量[7]。

1.2.4 揮發(fā)性風味物質檢測。通過內標法測定發(fā)酵產(chǎn)物中的乙酸乙酯和高級醇含量。樣品前處理：取50 mL樣品加入50 mL蒸餾水于250 mL蒸餾瓶中蒸餾，得50 mL蒸餾液。色譜條件為色譜柱 Agilent DB-WAX 122-7032：250 ℃、30 m×0.25 μm×0.25 mm;起始柱溫為50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至200 ℃保持3 min;載氣為高純氮氣（純度為 99.999%）;檢測器溫度為250 ℃，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為350 mL/min，尾吹速度為30 mL/min，分流比為 30∶1;進樣量為1 μL[8]。

1.2.5 有機酸檢測。通過外標法測定發(fā)酵產(chǎn)物中的有機酸含量。樣品前處理：將樣品高速冷凍離心（10 000 r/min，10 min）取上清液，用流動相稀釋10倍，過0.22 μm孔徑濾膜。色譜柱：Agilent C18色譜柱 （4.6 mm × 250 mm ID，5 μm）;流動相：0.01 mol/L KH2PO4緩沖溶液（用磷酸調至pH為2.8）過 0.45 μm水系濾膜，流速 0.7 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長210 nm;進樣量10 μL[9]。

1.2.6 感官評價。由20名評委（10名女性和10名男性）品嘗，對該復合果酒進行感官評價。取樣品上清澄清液（20 mL）于酒杯中，按隨機順序給評委品嘗。在測試過程中，建議用飲用水沖洗上顎。對顏色、香氣、口感、酸度、風味和整體可接受性的得分有9個類別（1極度厭惡;2很不喜歡;3比較不喜歡;4略微不喜歡;5不喜歡也不討厭;6略微喜歡;7比較喜歡;8很喜歡;9非常喜歡）。記錄各項得分并繪制所有屬性的平均值[10]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理。應用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。其顯著性差異采用 SPSS 19.0 軟件中的 Duncans新復極差法進行分析（P<0.05）。采用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行做圖分析，其數(shù)值以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 異常維克漢姆酵母接種量的確定

由圖1可知，混菌發(fā)酵的酒精度為10.5%（體積比），而純菌發(fā)酵后的酒精度只有8.5%。混菌發(fā)酵過程中，酒精度不因異常維克漢姆酵母的接種量而改變。說明整個發(fā)酵過程中果酒酵母占主導作用，且異常維克漢姆酵母對果酒酵母發(fā)酵性能有促進作用。隨著異常維克漢姆酵母接種量的增大，發(fā)酵液中乙酸乙酯的含量隨之增多。當異常維克漢姆酵母接種量為1×106 CFU/mL，乙酸乙酯的產(chǎn)量最高，高達321.58 mg/L;接種量為2×105、4×105 CFU/mL時，其發(fā)酵酒中乙酸乙酯含量分別為50.55、91.05 mg/L。當接種量為4×104 CFU/mL時，與果酒酵母單獨發(fā)酵所產(chǎn)的乙酸乙酯含量（38.27 mg/L）沒有顯著性區(qū)別。當果酒中乙酸乙酯含量在80 mg/L以下，此化合物對果酒芳香有增益作用[11]。確定異常維克漢姆酵母菌的接種量為2×105 CFU/mL，其乙酸乙酯含量50.55 mg/L，比純菌發(fā)酵提高了32.10%，符合紅酒的品質標準（22.5～63.5 mg/L）[12]。

2.2 純菌與混菌發(fā)酵的變化規(guī)律

由圖2可知，純菌和混菌發(fā)酵自第6天后，發(fā)酵液中還原糖含量無顯著差異，說明2種發(fā)酵方式中酵母不再耗糖發(fā)酵，基本都已發(fā)酵穩(wěn)定，因此確定發(fā)酵時間為7 d。發(fā)酵第1天，純菌的耗糖速率比混菌的快;第1～2天，混菌發(fā)酵液中還原糖含量急速下降，耗糖速率劇增;發(fā)酵第2～7天，純菌與混菌耗糖速率逐漸平穩(wěn)，但混菌發(fā)酵的耗糖速率一直比純菌的快。說明異常維克漢姆酵母菌可以促進果酒酵母代謝，以提升其發(fā)酵力?；炀l(fā)酵結束后殘?zhí)橇繛?0 g/L，略高于成品干型紅酒的殘?zhí)橇恐笜耍ā? g/L）[13]。

2.3 優(yōu)化條件下混菌發(fā)酵對復合果酒風味物質的影響

2.3.1 混菌發(fā)酵對復合果酒中高級醇的影響。

果酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要醇類有異戊醇、異丁醇和β-苯乙醇[13]。由表1可知，混菌發(fā)酵產(chǎn)生的異戊醇、異丁醇比純菌發(fā)酵的產(chǎn)量分別高出8.93、5.20 mg/L，這表明異常維克漢姆酵母菌在混菌發(fā)酵中提高了異戊醇、異丁醇的生成量。該研究中混菌發(fā)酵產(chǎn)物中高級醇含量為251.09 mg/L，較純菌發(fā)酵產(chǎn)量（234.20 mg/L）提高了7.21%，但其值在300 mg/L以下[14]，對果酒的香氣和品質有增益作用。而β-苯乙醇的含量在純菌和混菌發(fā)酵中沒有顯著性差異，其含量為37～42 mg/L，符合紅酒氣味指標范圍（4～190 mg/L）[12]。

2.3.2 混菌發(fā)酵對復合果酒中酸類的影響。

表2測定了2種不同發(fā)酵方式下果酒中的滴定酸和有機酸。它們的滴定酸含量在統(tǒng)計學上無顯著差異，在4.2～4.4 g/L（以酒石酸計）。這與Pedro M.等[15]在異常維克漢姆酵母菌對紅酒的影響研究中測得的紅酒滴定酸的值（4.7～4.8 g/L）相近。混菌與純菌發(fā)酵液中主要有4種有機酸，其中酒石酸、乳酸、檸檬酸含量在統(tǒng)計學上沒有顯著差異性，其含量分別在0.8～1.2、1.5～2.0、0.8～1.5 g/L。但是，2種發(fā)酵方式產(chǎn)的蘋果酸含量在統(tǒng)計學上有顯著性差異?；炀l(fā)酵的果酒中蘋果酸含量比純菌發(fā)酵的低，但是兩者乳酸產(chǎn)量幾乎一樣，說明蘋果酸含量的差異與蘋果酸-乳酸發(fā)酵沒有關系，可能是受到異常維克漢姆酵母菌的影響導致混菌發(fā)酵產(chǎn)物中蘋果酸含量比純菌發(fā)酵的低。同時，混菌發(fā)酵的有機酸總酸值相比純菌發(fā)酵的值更低，這可以很好地提高果酒的芳香品質[16]。

2.4 感官評價

由圖3可知，異常維克漢姆酵母和果酒酵母混合發(fā)酵相比果酒酵母單獨發(fā)酵的產(chǎn)品感官評價得分更高，其整體可接受性得分7.68，顏色得分8.09，香氣得分7.94，酸度得分6.42，口感得分7.58，風味得分7.35。結果表明，混菌發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)品相對單菌發(fā)酵的口味更受歡迎，酒體澄清透明，顏色呈現(xiàn)紅寶石般明亮紅色，果香濃郁，果香與發(fā)酵味較為融合，味道偏酸，口感較豐富。

3 結論

該研究將麥芽汁、火龍果、葡萄、菠蘿按一定比例混合，糖度為200 g/L、pH為3.4，同時接種異常維克漢姆酵母2×105 CFU/mL和果酒酵母1×106 CFU/mL，22 ℃發(fā)酵7 d，得到復合果酒的酒精度為10.5%，相比純菌發(fā)酵提高了23.5%，乙酸乙酯含量為50.55 mg/L，高級醇總含量為251.09 mg/L，相比純菌發(fā)酵分別提高32.10%和7.21%，總有機酸略微降低至4.94 g/L，使釀造果酒的口味更優(yōu)良，且其主要風味指標都符合紅酒指標標準。該研究中通過異常維克漢姆酵母和果酒酵母混菌發(fā)酵復合果汁獲得具有紅酒風味特征的復合果酒，澄清透亮，具有典型的果酒香味和風格，這為南方水果的復合果酒釀造提供了可行性。用麥芽汁代替部分果汁進行發(fā)酵，其對菌體生長和發(fā)酵的影響尚待進一步研究。

參考文獻

[1] IZQUIERDO CAN～AS P M，PALACIOS GARCA A T，ROMERO E G.Enhancement of flavour properties in wines using sequential inoculations of non-“Saccharomyces”（“Hansenula” and “Torulaspora”） and “Saccharomyces” yeast starter[J].Journal of grapevine research，2011，50（4）：177-182.

[2] 岑濤，岳田利，袁亞宏，等.云南芒果中酵母菌分離鑒定及在芒果酒發(fā)酵中的應用[J].食品科學，2015，36（11）：119-124.

[3] YOU L， WANG S， ZHOU R P， et al.Characteristics of yeast flora in Chinese strongflavoured liquor fermentation in Yibin region of China[J].Journal of the institute of brewing，2016，122（3）：517-523.

[4] MARTNEZ A，VEGARA S，MART N，et al. Physicochemical characterization of special persimmon fruit beers using bohemian pilsner malt as a base[J].Journal of the institute of brewing，2017，123：319-327.

[5] 梁若楠，李洲，何松貴，等.麥芽糖化工藝的優(yōu)化及其對發(fā)酵的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2017，45（26）：99-101，112.

[6] 郭新光，馬佩選，王曉紅，等.葡萄酒、果酒通用分析方法：GB/T 15038—2006[S].北京：中國標準出版社，2016.

[7] 趙凱，許鵬舉，谷廣燁.3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J].食品科學，2008，29（8）：534-536.

[8] 吳軒德，李洲，周世水.白酒釀造中釀酒酵母與巴氏醋桿菌相互作用的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2017，33（12）：61-67.

[9] 向進樂，杜琳，郭香鳳，等.離子抑制反相高效液相色譜法測定菠蘿果酒中10種有機酸[J].中國食品學報，2014，14（6）：229-235.

[10] YE M Q，YUE T L，YUAN Y H，et al.Effects of sequential mixed cultures of Wickerhamomyces anomalus and Saccharomyces cerevisiae on apple cider fermentation[J].FEMS Yeast Research，2015，14（6）：873-882.

[11] RIBEREAUGAYON P，STRONESTREET E.Le dosage des anthoccyanes dans les vins rouges[J].Bull Soc Chim，1965，9：2649-2652.

[12] SOLES R M，OUGH C S，KUNKEE R E.Ester concentration differences in wine fermented by various species and strains of yeasts[J].American journal of enology and viticulture，1982，33（2）：94-98.

[13] SATORA P，TARKO T，SROKA P，et al.The influence of Wickerhamomyces anomalus killer yeast on the fermentation and chemical composition of apple wines[J].FEMS Yeast Research，2014，14（5）：729-740.

[14] RAPP ?A，MANDERY ?H.Wine aroma[J].Experientia，1986，42（8）：873-884.

[15] CAN～AS P M I，GARCIAROMERO E，MANSO J M H，et al. Influence of sequential inoculation of Wickerhamomyces anomalus and Saccharomyces cerevisiae in the quality of red wines[J].European food research and technology，2014，239（2）：279-286.

[16] SAAYMAN M，VILJOENBLOOM M. The biochemistry of malic acid metabolism by wine yeasts：A review[J].South African journal of enology and viticulture，2006，27（2）：113-122.