活體采卵技術(shù)在荷斯坦奶牛繁殖中的應(yīng)用

黃啟震 盧文瑾 王麗娟 等

摘要 [目的]為提高優(yōu)質(zhì)奶牛的繁殖力，保證低成本的情況下大量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胚胎，對荷斯坦奶牛采用活體采卵的方式采集卵母細(xì)胞。[方法]將4頭荷斯坦奶牛分為超排組和非超排組2組，超排組對試驗牛注射FSH，非超排組對對照牛不采取任何處理。對荷斯坦奶牛進(jìn)行活體采卵，并對卵母細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。[結(jié)果]共采集到12枚卵母細(xì)胞，經(jīng)過受精培養(yǎng)后有8枚受精卵發(fā)育良好。[結(jié)論]采用優(yōu)化的活體采卵程序并配合超排技術(shù)，能夠更好地利用良種奶牛，以達(dá)到動物胚胎生產(chǎn)和輔助生殖的目的。

關(guān)鍵詞 活體采卵;荷斯坦奶牛;體外受精

中圖分類號 S857.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0107-03

Abstract [Objective] ?To improve the ?fecundity of ?highquality breed cattle and produce mass of highquality embryo with low cost， ovum was collected from Holstein dairy cows by using ovum pickup technology. [Method] Four Holstein dairy cows were divided into two groups： superovulation group（A） and nonsuperovulation group（B）. The dairy cows in group A was injected with FSH， no treatment was made on dairy cows in group B. The ovum was collected from Holstein dairy cows by using B ultrasonic instrument and statistics on ?the number of collected ovum was made. [Result] ?12 oocytes were obtained， and 8 fertilized eggs developed well after fertilization culture. [Conclusion] This experiment adopted an optimized ovum pickup procedure combined with superovulation technology， which can make better use of improved dairy cows and achieve the production of animal embryo and assisted reproduction.

Key words Ovum pickup（OPU）;Holstein dairy cows;In vitro fertilization（IVF）

活體采卵技術(shù)（OPU），又稱為陰道穿刺采卵（IVR），是 1980年后興起的一種非常實用的實驗技術(shù)。近年來我國畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)以及胚胎技術(shù)發(fā)展迅猛，所以對優(yōu)質(zhì)胚胎的需求量日益增加，市場亟需一種可以推廣的新型技術(shù)來填補優(yōu)質(zhì)胚胎的空缺，活體采卵技術(shù)應(yīng)運而生。該技術(shù)具有非常顯著的優(yōu)勢，能夠大幅度提高優(yōu)質(zhì)奶牛的遺傳力，生產(chǎn)更多的優(yōu)質(zhì)胚胎，縮短世代間隔，加快奶牛的育種進(jìn)程，降低生產(chǎn)成本，尤其是在對未達(dá)到生育年齡[1]、超數(shù)排卵效果差、老齡[2]或妊娠[3-4]、繁殖障礙[5]的高產(chǎn)母牛進(jìn)行采卵表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。與此同時，活體采卵也有很多限制，比如需要更高端的器材設(shè)備、采卵操作難度更大，需要技術(shù)熟練的實驗操作人員來進(jìn)行操作。這些因素給活體采卵帶來了一定的影響，盡管如此，活體采卵技術(shù)能夠與體外受精、胚胎移植等技術(shù)進(jìn)行配合使用，對奶牛胚胎的生產(chǎn)、發(fā)育機理的研究以及輔助生育技術(shù)都發(fā)揮著非常重要的作用。

活體采卵技術(shù)和體外受精、胚胎移植已經(jīng)成為歐美一些發(fā)達(dá)國家的重要繁殖技術(shù)，并已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。OPU 結(jié)合分離X、Y精子的性別控制技術(shù)，可為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)體外性控胚胎開辟新途徑。OPU是一個非常先進(jìn)、重要的繁殖技術(shù)，對于加快優(yōu)質(zhì)奶牛的繁殖和培育速度，優(yōu)化牛群結(jié)構(gòu)，推動畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展具有重要作用。種源是畜牧業(yè)發(fā)展的重中之重。當(dāng)前我國畜牧生產(chǎn)中良種覆蓋率僅35%左右，約85%是從國外引進(jìn)的。畜禽種業(yè)正面臨著國際跨國種業(yè)集團(tuán)種源壟斷和產(chǎn)品進(jìn)入的雙重壓力。挖掘與利用動物種質(zhì)資源、揭示繁育機理、創(chuàng)新育種方法、實現(xiàn)高效快繁已成為當(dāng)前我國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的頭等大事。

1 材料與方法

1.1 供體牛

試驗所用的供體奶牛為4頭3～5歲體型大小相似、健康的荷斯坦奶牛，將其分為超排組（A組）和非超排組（B組）2組：A組，2頭奶牛使用FSH進(jìn)行處理;B組，2頭奶牛不使用FSH處理。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器。

活體采卵儀（B超儀、手柄、腳踏開關(guān)、采卵針、恒溫槽、真空泵、卵泡液收集管）、顯微鏡、PBS液、平皿、紙巾、長臂手套、消毒乙醇、麻醉劑、耦合劑、純水等。

1.2.2 試劑。PBS（Gibco）、肝素鈉、1%胎犢血清、100 μL/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素（Sigma）。

1.3 采卵前準(zhǔn)備

采卵前先將設(shè)備打開，并將采卵儀器設(shè)備連接好，使采卵針的方向調(diào)整到正確的出針位置，真空泵調(diào)至6.267 kPa，將收集管置于37.5 ℃恒溫槽中。供體牛站立保定，用4 mL 2%鹽酸利多卡因進(jìn)行硬膜外麻醉，將直腸中糞便全部清除，對外陰部進(jìn)行清洗和消毒，最后用干凈的紙巾檢驗清洗情況。

1.4 采卵

采用超聲波引導(dǎo)穿過陰道采集卵母細(xì)胞。用溫水濕潤探頭手柄，以便減少對牛的損害。右手將B超探頭伸入到母牛陰道穹隆處，左手通過直腸把握住卵巢并將其與B超探頭緊貼，使用B超儀觀察卵巢的輪廓和卵泡。同時，移動卵巢使要穿刺的卵泡位于采卵器的出針位置，用把握探頭的手推動進(jìn)針管，使針頭刺破陰道壁和卵泡壁，將卵母細(xì)胞及卵泡液吸入收集管中。

1.5 卵母細(xì)胞的體外成熟（IVM）

培養(yǎng)液為8.63 mL TCM-199+1 mL FBS（Gibco）+20 μL ?FSH、10 μL LH、100 μL E2、肝素25 μL、10 μL EGF、100 μL IGF、10 μL PS。在培養(yǎng)皿中滴100 μL培養(yǎng)液，將 COCs加入到培養(yǎng)液中，然后加入石蠟油正好沒過培養(yǎng)液，在38.5 ℃、95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）中成熟22～24 h。

1.6 卵母細(xì)胞的體外受精（IVF）

從液氮中取出精液，在空氣中晃動10 s直至精液管上的液氮揮發(fā)完畢，放入38.5 ℃的溫水中解凍約30 s。用乙醇棉擦拭管壁，然后減掉一端封口后，將其垂直放入含有2.0 mL洗精液的離心管口處，再減掉另一端封口，加入4.0 mL洗精液，并吹打混勻，放入離心機中1 800 r/min離心3 min。然后，去上清4.0 mL，加入4.0 mL洗精液，1 800 r/min離心3 min;去上清5.8 mL，最后加入600 μL受精液，備用。

將成熟的卵母細(xì)胞吸出，放入Hepes液吹打使擴散的顆粒細(xì)胞脫落，保留3～5層顆粒細(xì)胞。再將其用受精液洗2～3遍，然后放入50 μL受精滴中。吸取50 μL獲能精液加入到受精滴中。在溫度38.5 ℃、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。

1.7 受精卵的體外培養(yǎng)（IVC）

受精結(jié)束后，將受精卵吸入胚胎培養(yǎng)前液中洗2～3遍，將其放入50 μL胚胎培養(yǎng)前液中，在溫度38.5 ℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后吸出25 μL胚胎培養(yǎng)前液，加入25 μL胚胎培養(yǎng)后液，受精后第4天再半量換胚胎培養(yǎng)后液。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵母細(xì)胞計數(shù)與分級 由表1可知，試驗共獲得12枚卵母細(xì)胞，超排組采集到10枚卵母細(xì)胞，非超排組采集到2枚卵母細(xì)胞。超排組卵母細(xì)胞數(shù)顯著大于非超排組。與非超排組相比，超排組的優(yōu)質(zhì)卵泡比例顯著低于非超排組。這表明通過超數(shù)排卵處理雖然顯著增加了卵母細(xì)胞的數(shù)量，但對卵母細(xì)胞的質(zhì)量會產(chǎn)生一定的影響。

2.2 受精卵發(fā)育狀態(tài)觀察

從圖1可以看出，將采集到的卵母細(xì)胞分別進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精以及體外培養(yǎng)等，最終得到8枚發(fā)育良好的胚胎，其中死亡的4枚胚胎應(yīng)為Ⅳ級卵母細(xì)胞。雖然活體采卵技術(shù)可以降低成本，配合超排技術(shù)可得到數(shù)量可觀的卵母細(xì)胞，但在胚胎存活率方面也存在著弊端?？傮w來看，活體采卵技術(shù)在荷斯坦奶牛繁殖中起著不可替代的作用。

3 討論

活體采卵技術(shù)優(yōu)點是能夠?qū)⒛感蟮南底V進(jìn)行清楚記錄，還可對后備老年奶牛進(jìn)行卵母細(xì)胞的采集，加快畜牧業(yè)的發(fā)展[6]。提高優(yōu)質(zhì)母畜卵母細(xì)胞的利用率，對優(yōu)良母畜以及珍稀動物的遺傳資源有著重要意義。該技術(shù)能使超數(shù)排卵效果差、老齡高產(chǎn)的奶牛持續(xù)提供卵子，并可利用那些有繁殖障礙的牛，使母牛得到充分利用，再結(jié)合體外受精和胚胎移植等技術(shù)，可以大大提高優(yōu)質(zhì)母畜的繁殖潛力，生產(chǎn)更多的優(yōu)質(zhì)胚胎，降低優(yōu)質(zhì)胚胎的成本[7-8]，為畜牧業(yè)的發(fā)展提供更多的技術(shù)支持。最重要的是，使用活體采卵技術(shù)，無需將供體奶牛屠宰，可以重復(fù)使用供體牛，大大節(jié)約成本，體現(xiàn)動物福利。Bao等[9]研究表明當(dāng)體內(nèi)FSH的水平升高時，原始卵泡的數(shù)量也會相應(yīng)增加，縮短原始卵泡在卵巢中停留的時間。顆粒細(xì)胞產(chǎn)生FSH受體與FSH有關(guān)，當(dāng)受體數(shù)量增加時卵泡顆粒細(xì)胞對FSH的應(yīng)答也越來越明顯，從而促使顆粒細(xì)胞的持續(xù)發(fā)育。

該試驗結(jié)果表明，使用FSH激素處理供體牛，可以增加卵巢上的可見卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)，質(zhì)量卻沒有減弱。該試驗通過活體采卵技術(shù)共采集到12枚卵母細(xì)胞，其中8枚在受精后發(fā)育良好。Chaubal等[10] 使用FSH處理，每頭平均卵泡數(shù)為（16.0±5.0），每次采卵頭均獲可用胚（2.1±1.2）枚。De Roover等[11]使用FSH，每頭平均穿刺卵泡數(shù)為（11.9±7.7）枚，平均獲卵母細(xì)胞（5.6±4.1）枚，優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞率為32%，每頭能獲得可用胚（2.0±2.3）枚?；铙w采卵可對供體牛進(jìn)行長期采卵，并能達(dá)到良好效果。Merton等[12]研究表明對活體采卵牛采用FSH處理，頻率為每14 d 1次，每次可獲得3.3個可用胚胎。 Goodhand等[13]、江明生等[14]研究也表明，經(jīng)過FSH處理的母牛在增加卵泡數(shù)的同時，還可以提高卵母細(xì)胞的數(shù)量。佟桂芝等[15]研究表明，每周采集2次獲取的卵母細(xì)胞的質(zhì)量比每周采集1次的卵母細(xì)胞的質(zhì)量高，而采卵頻率與是否使用激素有關(guān)，激素處理后每周可采集1次，無激素處理組每周可采集2次，可采卵泡總數(shù)無顯著差異。Reichenbach等[16]研究表明用PMSG處理并不能提高供體牛的卵泡數(shù)量和卵母細(xì)胞數(shù)。此結(jié)果與很多因素有關(guān)，不同的激素及其劑量、個體差異、操作人員的熟練程度和季節(jié)因素都會對結(jié)果產(chǎn)生巨大差異。該試驗在采卵過程中，由于操作不當(dāng)導(dǎo)致一頭牛體內(nèi)出血，這也說明在節(jié)約成本提高效率的同時，該試驗技術(shù)對奶牛的損害也不容忽視。

總而言之，活體采卵技術(shù)能從系譜明確的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛中獲得卵母細(xì)胞;活體采卵技術(shù)能使年輕、老齡、妊娠、超數(shù)排卵效果不理想的奶牛持續(xù)供給卵子，大大加快育種的進(jìn)程;活體采卵技術(shù)能夠充分挖掘優(yōu)質(zhì)母牛的繁殖潛力，批量生產(chǎn)良種胚胎，降低優(yōu)質(zhì)胚胎的生產(chǎn)成本，并能為卵核移植、基因工程、胚胎工程等研究提供必需的材料。OPU 技術(shù)在奶牛繁育中有著非常廣闊的應(yīng)用前景，而更加安全有效的活體采卵方式需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

使用優(yōu)化后的活體采卵技術(shù)配合超排技術(shù)、IVM、IVF等技術(shù)，能降低成本并更好地利用良種奶牛，以達(dá)到動物胚胎生產(chǎn)和輔助生殖的目的。

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