電針預(yù)處理不同原絡(luò)配穴對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織TNF-α、COX-2、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

邵雪芳，蔡榮林，曹 奕,吳生兵,吳子建，王璐璐，劉 磊，鄭良玉，李小賈

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230038)

目前心血管疾病已成為中國居民的第一位死因，占總死亡人數(shù)的40%，其中引起心血管疾病最基本的病因是心肌缺血[1]。而治療心肌缺血的重要療法，如介入治療、溶栓、搭橋術(shù)，均可能引起心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2]。因此，如何減輕MIRI是治療急性心肌缺血亟待解決的臨床問題。針刺為心肌缺血的預(yù)防和治療提供了綠色的治療方案[3]。多項(xiàng)研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，針刺保護(hù)缺血心肌的作用是確切的[4-6]，而且選穴或配穴不同，其治療效果存在一定的差異。

腧穴配伍可以起到加強(qiáng)腧穴間的協(xié)同作用，從而提高臨床療效。原絡(luò)配穴是臨床最常用的經(jīng)典配穴法之一。但是目前關(guān)于原絡(luò)配穴法在干預(yù)急性心肌缺血方面的實(shí)驗(yàn)研究較少。前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，“神門”+“支正”的原絡(luò)配穴方法可以明顯提高急性心肌缺血家兔的心功能?！皟?nèi)關(guān)”穴針刺預(yù)處理對MIRI的保護(hù)作用已被大量研究[8-12]所證實(shí)。為進(jìn)一步探討電針不同穴組對急性心肌缺血保護(hù)的效應(yīng)機(jī)制及差異性，本研究通過觀察電針不同原絡(luò)配穴對急性MIRI大鼠心肌組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2, COX-2)表達(dá)的影響，探討原絡(luò)配穴法改善急性MIRI的可能機(jī)制，為臨床選穴配穴提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(230±20)g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2014-0007]。

1.2 主要試劑與儀器 PVDF膜(批號 K5CA1685L)：Millipore公司；異丙醇(批號 20160614)：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；β-actin(批號 17AV0303，分子量43 kDa)、山羊抗小鼠IgG(批號 127655)、山羊抗兔IgG(批號 125946)：北京中杉。EPS 300型電泳儀、VE-186型轉(zhuǎn)膜儀、VE-180型電泳槽：Tanon；LX 300型微量離心機(jī)、TS-1000水平搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；微量移液器：德國Eppendorf；磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

2 方法

2.1 大鼠分組和模型復(fù)制 實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定對動物進(jìn)行處置。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，從40只大鼠中隨機(jī)選取6只作為假手術(shù)組，從模型復(fù)制成功后的大鼠中選取30只，將其隨機(jī)分為模型對照組、電針神門+支正組(簡稱神門支正組)、電針神門+通里組(簡稱神門通里組)、電針大陵+內(nèi)關(guān)組(簡稱大陵內(nèi)關(guān)組)、電針大陵+外關(guān)組(簡稱大陵外關(guān)組)，每組6只。模型復(fù)制方法參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行改進(jìn)。大鼠在末次電針24 h后腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)麻醉，仰臥位固定后實(shí)時記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖(electrocardiogram,ECG)。自左側(cè)第3—4肋間剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，打開胸腔，剪開心包膜，在冠狀動脈左前降支起點(diǎn)外1～2 mm處，以5-0號無菌帶線縫合針刺入約0.5 mm，結(jié)扎左前降支血管(在絲線與心肌間放一根聚乙烯小管)，見缺血心肌壁呈現(xiàn)發(fā)紺、膨出，快速將心臟送回胸腔內(nèi)原位置，醫(yī)用縫合線兩端留置在體外，用長嘴止血鉗將胸部皮膚、肌肉和心臟掛線夾緊，防止發(fā)生氣胸。心電圖ST段弓背上抬，T波高聳，確定心肌缺血形成。30 min后松開結(jié)扎線后關(guān)閉胸腔，再灌注120 min，心電圖示ST段回落1/2以上。模型復(fù)制結(jié)束時，逐層縫合肌肉、皮膚，切口處注入少許青霉素注射液，再次采用碘伏進(jìn)行無菌操作，預(yù)防感染。假手術(shù)組開胸后不結(jié)扎冠狀動脈，僅在相應(yīng)部位用針空穿1次即可。剔除各組實(shí)驗(yàn)前心電圖不正常的大鼠，或未到觀察終點(diǎn)而死亡者以及模型復(fù)制不成功者。

2.2 電針干預(yù)方法 腧穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[14]，并結(jié)合動物比較解剖學(xué)方法定位進(jìn)行取穴?！吧耖T”穴：前肢內(nèi)側(cè)，腕部橫紋尺骨邊緣?！爸д毖ǎ呵爸邆?cè)緣前臂腕關(guān)節(jié)背側(cè)上2/5折點(diǎn)處?！巴ɡ铩毖ǎ捍笫笄爸珒?nèi)側(cè)，腕橫紋正中上1 mm處?！皟?nèi)關(guān)”穴：位于大鼠前肢內(nèi)側(cè)，腕橫紋正中上3 mm處?！巴怅P(guān)”穴：腕關(guān)節(jié)上3 mm，尺、橈骨之間?！按罅辍毖ǎ呵爸珒?nèi)側(cè)腕部橫紋正中間。刺入深度3～5 mm，間隔3～5 mm，接用華佗牌SDZ-Ⅴ型電子針療儀進(jìn)行電針刺激，刺激電壓1 V，頻率為2 Hz，每日1次，每次20 min，模型復(fù)制前共刺激14 d。假手術(shù)組和模型對照組不予以電針刺激。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 ECG記錄與分析 各組大鼠在模型復(fù)制前連接Power lab生理記錄儀，同步監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)ECG。持續(xù)記錄模型復(fù)制前、結(jié)扎后30 min及再灌注后120 min時間點(diǎn)的ECG，每次分析15 min內(nèi)的ST段位移值。

2.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平 ①采集標(biāo)本：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠仰臥于手術(shù)臺上，固定頭部及四肢，開胸，迅速取出心臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗，冰盤上切取左冠狀動脈供血區(qū)0.5 cm×0.5 cm大小心肌組織，放入甲醛中固定，室溫保存。②采用免疫組織化學(xué)法檢測心肌TNF-α、ICAM-1、COX-2免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。通過ALTAU2圖像采集卡采集圖像，采用ImagePro Plus 4.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖形分析，TNF-α、ICAM-1、COX-2在胞核呈現(xiàn)棕黃色陽性表達(dá)。計(jì)算每個視野陽性表達(dá)面積之和及光密度均值，以陽性點(diǎn)面積之和與陽性點(diǎn)光密度均值之比作為蛋白的表達(dá)水平。

2.3.3 Westernblot法檢測COX-2表達(dá)水平 另取缺血區(qū)0.5 cm×0.5 cm大小心肌組織，立即置于-80 ℃冰箱中凍存待測，每組選取3只大鼠。剪取心肌組織，稱取100 mg左右的樣品，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。收集上清液，經(jīng)電泳后，在收集的蛋白樣品中加入緩沖液。經(jīng)熱浴10 min后。待樣品冷卻到室溫后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、ECL顯色等，采用Western blot法檢測心肌組織COX-2蛋白。將獲得的膠片用掃描儀掃描，獲取圖片上目標(biāo)特異條帶灰度值后采用Chemi Analysis進(jìn)行分析，以所得到的COX-2灰度值分別與內(nèi)參β- actin的吸光度比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠ECG ST段位移值比較 各組大鼠模型復(fù)制前ST段位移值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。除假手術(shù)組外，其他組大鼠結(jié)扎后30 min，ST段位移值均較模型復(fù)制前顯著升高(P<0.05)，再灌注120 min時ST段位移值較結(jié)扎后30 min時顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，結(jié)扎后30 min，各電針預(yù)處理組ST段位移值均顯著降低(P<0.05)，再灌注120 min，除大陵外關(guān)組外其他3個電針預(yù)處理組ST段位移值顯著降低(P<0.05)；再灌注120 min后，神門支正組ST段位移值最低，大陵外關(guān)組ST段位移值最高，兩組ST段位移值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠缺血期與再灌注期ST段位移值比較

注：以開胸前ST段基線或J波起點(diǎn)為基礎(chǔ)值；與模型復(fù)制前比較，aP<0.05；與結(jié)扎后30 min比較，bP<0.05；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與神門支正組比較，△P<0.05，與神門通里組比較，◇P<0.05

3.2 采用免疫組織化學(xué)方法檢測的各組大鼠心肌組織TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠心肌組織TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，各電針預(yù)處理組TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與神門支正組比較，大陵內(nèi)關(guān)組和大陵外關(guān)組TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與神門通里組比較，大陵外關(guān)組TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2。

3.3 采用Western blot法檢測的各組大鼠心肌組織COX-2蛋白相對表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠心肌組織COX-2蛋白相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，各電針預(yù)處理組COX-2蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；神門支正組COX-2蛋白相對表達(dá)水平最低，大陵外關(guān)組COX-2蛋白相對表達(dá)水平最高，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

4 討論

《針灸大成》首次提出原絡(luò)配穴法，后世把表里經(jīng)主客原絡(luò)配穴法演化為3種配穴方法，即表里經(jīng)原絡(luò)配穴法、本經(jīng)原絡(luò)配穴法、異經(jīng)原絡(luò)配穴法[15-16]。臨床上，它們可以相互配合應(yīng)用，提高治療效果。有研究表明，電針不同配穴對心肌缺血大鼠的腦保護(hù)作用有協(xié)同效應(yīng)，原絡(luò)配穴和原俞配穴的作用優(yōu)于單穴治療[17]。本研究擬選取不同的本經(jīng)原絡(luò)配穴和相表里經(jīng)原絡(luò)配穴，觀察電針不同原絡(luò)配穴對急性MIRI大鼠心肌組織TNF-α、COX-2、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響，探討原絡(luò)配穴針刺改善急性MIRI的可能機(jī)制。

神門是手少陰心經(jīng)的原穴，《素問·刺瘧》《針灸甲乙經(jīng)》記載：“心瘧者，令人煩心，甚欲得清水，反寒多不甚熱，刺手少陰(神門)”。通里是手少陰心經(jīng)絡(luò)穴，針刺通里穴可治療心悸、怔忡、舌強(qiáng)不語、腕臂痛等疾患。有學(xué)者[18]基于“心主血脈”及臟腑經(jīng)脈相關(guān)理論，證實(shí)針刺心經(jīng)經(jīng)穴能明顯改善急性心肌缺血。支正是手陽明小腸經(jīng)的絡(luò)穴，神門與支正配伍是相表里經(jīng)的原絡(luò)配穴。大陵和內(nèi)關(guān)是手厥陰心包經(jīng)原絡(luò)穴，心包經(jīng)與心在生理上具有特異性聯(lián)系，二者在病理上相互影響。《靈樞·經(jīng)脈》曰：“心主手厥陰心包絡(luò)之脈，起于胸中，出屬心包絡(luò)，下膈，歷絡(luò)三焦?！薄夺t(yī)學(xué)綱目》謂：“心胸痛并氣攻，勞宮、大陵、內(nèi)關(guān)?！贬槾虄?nèi)關(guān)對心功能性疾病有獨(dú)特的療效。后代醫(yī)家有“胸肋苦有病，速與內(nèi)關(guān)謀”之說。外關(guān)穴是手少陽三焦經(jīng)的絡(luò)穴，臨床上治療熱病、胸脅痛、上肢痿痹等疾病，大陵與外關(guān)是相表里經(jīng)的原絡(luò)配穴，對心臟功能有一定的影響。

注：鏡下可見染色質(zhì)深染聚集成塊或碎裂，核邊聚集；棕黃色顆粒表示蛋白表達(dá)陽性，棕黃色顆粒越多和顏色越深提示蛋白表達(dá)水平越高

圖1 各組心肌組織TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)染色，10×40倍)

注：A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.神門支正組；D.神門通里組；E.大陵內(nèi)關(guān)組；F.大陵外關(guān)組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與神門支正組比較，△P<0.05；與神門通里組比較，◇P<0.05

注：A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.神門支正組；D.神門通里組；E.大陵內(nèi)關(guān)組；F.大陵外關(guān)組

圖3Westernblot法檢測各組大鼠心肌組織COX-2蛋白相對表達(dá)水平

現(xiàn)代研究表明，炎癥反應(yīng)在缺血再灌注過程中會引起臟器繼發(fā)性損傷[19]，同時也會導(dǎo)致釋放大量的細(xì)胞因子。有研究認(rèn)為，炎癥遞質(zhì)和細(xì)胞黏附分子在炎癥細(xì)胞浸潤的過程中發(fā)揮著重要作用，而針刺能夠有效地抑制炎癥遞質(zhì)的釋放，降低黏附分子的表達(dá)[20]，減輕炎癥細(xì)胞的聚集，最終可以減輕損傷。目前普遍認(rèn)同COX-2是一類炎癥反應(yīng)遞質(zhì)，從而可作為治療炎癥疾病的一個靶標(biāo)。正常生理狀態(tài)下，組織細(xì)胞中COX-2表達(dá)水平較低或不表達(dá)，當(dāng)機(jī)體受到炎癥、疼痛等刺激時，其表達(dá)水平顯著提高[21-22]。在心肌缺血過程中，心肌細(xì)胞COX-2的作用有不同的報(bào)道[23]。在實(shí)驗(yàn)小鼠敲除基因后，會增加其心肌纖維化的概率，表明COX-2對正常心肌的功能有一定的保護(hù)作用[24-25]。但更多的觀點(diǎn)傾向于心肌組織COX-2的過多表達(dá)會對MIRI有損傷作用[26-27]。有研究[28-29]發(fā)現(xiàn)，心肌缺血過程中有明顯的炎癥反應(yīng)，而環(huán)氧化酶抑制劑會減輕對實(shí)驗(yàn)性心肌缺血的損傷。然而局部缺血導(dǎo)致的COX-2過多表達(dá)與MIRI中細(xì)胞凋亡之間的機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果表明，COX-2在心肌缺血再灌注模型中表達(dá)水平顯著增多，針刺預(yù)處理后，心肌組織中COX-2水平明顯降低，提示針刺可以抑制缺血心肌的炎癥反應(yīng)，對心肌起到一定的保護(hù)作用。

注：A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.神門支正組；D.神門通里組；E.大陵內(nèi)關(guān)組；F.大陵外關(guān)組；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與神門支正組比較，△P<0.05；與神門通里組比較，◇P<0.05

TNF-α是一類促炎細(xì)胞因子，可促使缺血組織區(qū)域白細(xì)胞增加，進(jìn)而釋放大量的促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致缺血區(qū)域損傷加重。研究顯示，缺血再灌注的過程引起強(qiáng)烈的心臟收縮，導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜受損，最終進(jìn)一步增加TNF-α的釋放[30]。而直接靶向抑制TNF-α之類促炎細(xì)胞因子的釋放可有效改善和治療MIRI[31]。通過電針療法能顯著減少腦缺血再灌注模型大鼠模型復(fù)制后TNF-α和IL-6的含量[32]，減輕心肌損傷。胡惠林等[33]研究表明，針灸預(yù)處理顯著抑制炎癥相關(guān)蛋白TNF-α、VCAM-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和核因子-κB的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，模型對照組大鼠較假手術(shù)組TNF-α的表達(dá)水平顯著升高，各電針預(yù)處理組與模型對照組比較，TNF-α表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)針灸預(yù)處理對MIRI具有保護(hù)作用。

ICAM-1是一個重要的黏附分子，其在靜息的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)水平低，但在多種炎癥因子的刺激下會增加表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)研究[34]表明，針刺療法可以同時降低腦缺血再灌注損傷大鼠健側(cè)和患側(cè)腦區(qū)ICAM-1和IL-1β的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)作用。同時，也有發(fā)現(xiàn)通過眼針可以降低模型動物腦組織ICAM-1表達(dá)水平，改善腦功能損傷[35]。研究證明，IL-1β、TNF-α等炎癥因子會在心肌缺血或再灌注損傷過程中升高，其增加ICAM-1和內(nèi)皮中白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌內(nèi)中性粒細(xì)胞的黏附、聚集，并進(jìn)一步釋放可溶性遞質(zhì)，最終加重心肌組織損傷[36-38]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，各電針預(yù)處理組TNF-α、ICAM-1、COX-2表達(dá)水平明顯降低，表明電針預(yù)處理可降低TNF-α水平，抑制缺血心肌組織ICAM-1、COX-2的表達(dá)，從而起到保護(hù)缺血心肌損傷的作用。

本研究初步證實(shí)電針不同原絡(luò)配穴預(yù)處理可顯著改善急性MIRI，不同本經(jīng)、表里經(jīng)原絡(luò)配穴的效應(yīng)之間存在一定的差異。同時研究結(jié)果顯示，電針預(yù)處理不同原絡(luò)配穴可降低急性MIRI大鼠心肌組織TNF-α、COX-2、ICAM-1表達(dá)水平，減少COX-2蛋白的相對表達(dá)水平，抑制黏附分子和炎癥反應(yīng)。因此，電針預(yù)處理可顯著抑制急性MIRI大鼠心肌組織炎癥遞質(zhì)COX-2、促炎細(xì)胞因子TNF-α的釋放及黏附分子ICAM-1的表達(dá)，減輕炎癥細(xì)胞在急性心肌缺血再灌注組織器官中的聚集，從而減輕缺血再灌注后炎癥反應(yīng)的損害，對心肌有良好的保護(hù)作用，且不同原絡(luò)配穴組之間具有一定的相對特異性。同時，由于缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)通路較為復(fù)雜，可能涉及多個信號調(diào)節(jié)通路的交互過程，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。