發(fā)酵透明質(zhì)酸寡糖獸疫鏈球菌工程菌株的構(gòu)建

韋朝寶，堵國成，陳堅(jiān)，康振

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

透明質(zhì)酸 (Hyaluronic acid，簡稱HA)，又名玻璃酸，是于1934年在牛眼玻璃體中檢測到的線性大分子酸性黏多糖[1]，其分子結(jié)構(gòu)由 (1-β-4) D-葡萄糖醛酸 (1-β-3) N-乙?；?D-氨基葡萄糖的雙糖單位重復(fù)連接而成[2]。HA以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能[3-6]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化妝品、食品等領(lǐng)域。HA的市場需求日益增大[7]，2012年?duì)I銷價(jià)值超過50億美元，預(yù)計(jì)2019年將達(dá)到98.5億美元[8]。

大分子HA傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是從動物組織 (如公雞雞冠或臍帶等) 通過化學(xué)方法提取而得[9]，受到原料少、工藝程序復(fù)雜、產(chǎn)品提取率極低、生產(chǎn)成本高等因素的影響，動物組織提取法已經(jīng)逐漸被通過C族鏈球菌等毒性減弱菌株進(jìn)行微生物合成所取代[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，市場上存在的HA超過90%是來自C群的獸疫鏈球菌以及來自最近應(yīng)用的枯草芽孢桿菌所生產(chǎn)[11]。研究表明HA的生物活性和使用效果由其相對分子量 (Mw) 直接決定[12]。大分子HA (分子量在100 萬Da以上)具有較好的彈性與保濕性，具有抑制炎性反應(yīng)、潤滑和藥物緩釋等功能[12]，常用于眼科手術(shù)黏彈劑[13-14]、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療[15-16]、化妝品、皮膚燒傷愈合及術(shù)后防粘連等[12]。

相比于大分子量的HA，透明質(zhì)酸寡糖 (分子量低于1萬Da) 具有重要的生理活性與特殊生理功能，透明質(zhì)酸寡糖能滲入真皮，具有輕微擴(kuò)張毛細(xì)血管、增加血液循環(huán)、改善中間代謝、促進(jìn)皮膚營養(yǎng)吸收作用；具有較強(qiáng)的消皺功能，可增加皮膚彈性，延緩皮膚衰老[12,16]。透明質(zhì)酸寡糖還具有促血管生成[17]、促創(chuàng)傷愈合[18]、免疫調(diào)節(jié)活性[19]和抗腫瘤活性等作用[20]。透明質(zhì)酸寡糖在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[21]。當(dāng)前制備透明質(zhì)酸寡糖的方法主要集中于物理法[22-23]、化學(xué)法[24-25]、酶解法[26]。物理法操作過程簡單，但效率較低，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差[22-23]?；瘜W(xué)法引入化學(xué)試劑，造成污染，反應(yīng)條件復(fù)雜，產(chǎn)生大量工業(yè)廢水[24-25]。酶解法所使用的透明質(zhì)酸酶昂貴、步驟繁瑣，也不是大量合成透明質(zhì)酸寡糖的高效方法[26]。近年來，不少研究者試圖通過直接發(fā)酵生產(chǎn)低分子量HA[27-28]。隨著合成生物學(xué)、代謝工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展，通過合理設(shè)計(jì)來獲得增強(qiáng)生產(chǎn)目標(biāo)代謝物的工程菌株已變得越來越普遍[29]。構(gòu)建工程菌株實(shí)現(xiàn)從廉價(jià)碳源 (例如蔗糖或葡萄糖) 一步合成透明質(zhì)酸寡糖是非常有前景和吸引力的選擇。最近，Jin等合理設(shè)計(jì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis168的HA合成途徑進(jìn)行發(fā)酵合成透明質(zhì)酸寡糖：一方面，將枯草芽孢桿菌HA合成途徑中的各種基因組合過表達(dá)；另一方面，通過用TTG替換天然ATG起始密碼子下調(diào)pfkA(6-磷酸果糖激酶，PfkA) 的表達(dá)，然后將水蛭來源的透明質(zhì)酸水解酶LHyal基因整合到基因組上，通過LHAase的RBS序列優(yōu)化和N-端融合His標(biāo)簽策略，合理調(diào)節(jié)LHAase的表達(dá)，有效地生產(chǎn)特定分子量HA，最終獲得一株在3 L發(fā)酵罐發(fā)酵100 h時(shí)HA累積至19.38 g/L的高產(chǎn)菌株[30]。重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵合成HA的生產(chǎn)周期過長，生產(chǎn)強(qiáng)度較低，而商業(yè)生產(chǎn)HA最廣泛使用的獸疫鏈球菌[3,31]，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)強(qiáng)度較強(qiáng)。相比之下，獸疫鏈球菌是一個(gè)強(qiáng)大且具有高成本效益的HA生產(chǎn)平臺[32]。本研究在獸疫鏈球菌WSH-24中過表達(dá)nisA啟動子控制下透明質(zhì)酸合酶HasA，優(yōu)化在高葡萄糖濃度下的誘導(dǎo)劑乳酸鏈球菌素用量，然后進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)水蛭來源的透明質(zhì)酸酶LHAase，使重組菌在合成HA的同時(shí)也能對HA進(jìn)行降解，有效緩解發(fā)酵過程的溶氧問題，提高透明質(zhì)酸寡糖產(chǎn)量。具體研究內(nèi)容如圖1所示。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

所用菌株和質(zhì)粒詳見表1。

1.1.2 酶、引物、DNA marker及相關(guān)試劑盒

PCR引物 (表2) 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成；Primer star DNA聚合酶和TaqDNA 聚合酶購自寶賽生物 (杭州) 有限公司；DNA marker購自TaKaRa (大連)；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、氯霉素和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；乳酸鏈球菌素購自Sigma-Aldrich，考馬斯亮藍(lán)染色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；其他化學(xué)試劑購自國藥的分析純。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化鈉10.0；固體LB培養(yǎng)基需添加20.0 g/L瓊脂粉。

THY培養(yǎng)基 (g/L)：牛肉浸粉10.0，胰蛋白胨20.0，葡萄糖2.0，碳酸氫鈉2.0，氯化鈉2.0，磷酸氫二鈉0.4，酵母粉2.0，pH 7.2。

斜面培養(yǎng)基 (g/L)：心腦浸粉 (BHI) 37.0，葡萄糖10.0，酵母粉10.0，瓊脂粉20.0，pH 7.2。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 (蔗糖) 20.0，酵母粉20.0，七水合硫酸鎂2.0，四水合硫酸錳0.1，磷酸二氫鉀2.0，碳酸鈣20，微量元素1 mL/L，緩沖液40 mL/L，pH 7.2。

圖1 重組獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸寡糖合成路線示意圖Fig.1 Schematic diagram of the synthesis route of hyaluronan oligosaccharide in recombinant Streptococcus zooepidemicus.

表1 本文所用的質(zhì)粒與菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

微量元素 (g/L)：氯化鈣2.0，氯化鋅0.046，五水合硫酸銅0.019。

緩沖液 (g/L)：磷酸氫二鈉36.76，磷酸二氫鈉15.98，碳酸氫鈉12.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉20，磷酸氫二鈉6.2，硫酸鉀1.3，葡萄糖 (蔗糖) 80，七水合硫酸鎂2.0，微量元素1 mL/L，谷氨酰胺 2.0，pH 7.2。

1.2.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將斜面種子接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，根據(jù)需要加入終濃度為5 μg/mL氯霉素，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14-16 h。

搖瓶發(fā)酵：將種子培養(yǎng)液按10%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，根據(jù)需要加入終濃度為5 μg/mL氯霉素和40 ng/mL乳酸鏈球菌素，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

3 L發(fā)酵罐發(fā)酵：按10%的接種量將種子液接入含1.35 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，根據(jù)需要加入終濃度為5 μg/mL氯霉素和40 ng/mL乳酸鏈球菌素，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量1.0 v/(v·min)，溫度37 ℃，使用5 mol/L NaOH 溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)以控制pH為7.0，在8 h期間開始流加速葡萄糖保持5 g/(L?h)的流速至發(fā)酵結(jié)束。

表2 本文所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.3 相關(guān)方法

1.3.1 制備獸疫鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞

將優(yōu)良單菌落接入5 mL THY液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃下培養(yǎng)10-14 h。按1%的接種量接入新鮮的40 mL的THY液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)至OD530為0.4左右時(shí)加入無菌的LHAase溶液10 mL (酶活5×105U/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)約30 min后將其冰浴10 min。6 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體，加入提前冰浴的0.5 mol/L的蔗糖溶液20 mL重懸菌體。重懸菌體和離心重復(fù)操作2次，加入500 μL 15%甘油的0.5 mol/L的蔗糖溶液，重懸菌體后進(jìn)行分裝。

1.3.2 獸疫鏈球菌的電轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定

將5 500 ng質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴10 min后加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯里進(jìn)行電激，電壓為2 500 V (2 mm電轉(zhuǎn)杯)。電激后將900 μL冷THY培養(yǎng)液加入電轉(zhuǎn)杯中，混勻后吸出置于離心管中，冰浴30 min。37 ℃靜置培養(yǎng)1.5-2.5 h后涂布于帶有氯霉素抗性的THY板。37 ℃培養(yǎng)24-48 h，挑選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測序鑒定。

1.3.3 菌體生長密度測定

取1 mL發(fā)酵液加入適量稀HCl溶解CaCO3，10 000 r/min離心5 min。收集菌體，用蒸餾水重懸，適當(dāng)稀釋菌液后測定600 nm波長下的吸光值(用蒸餾水調(diào)零)。

1.3.4 透明質(zhì)酸寡糖樣品的分離純化

取5 mL發(fā)酵液，加入終濃度為0.1% (W/V)的十二烷基硫酸鈉 (SDS)，顛倒混勻后室溫下靜置10 min。10 000 r/min離心10 min，將收集的上清液加入TCA調(diào)pH值至4.5，75 ℃水浴20 min后，10 000 r/min離心10 min，再將收集的上清液用NaOH調(diào)pH值至7.0后加入7倍體積的無水乙醇，顛倒混勻后置于4 ℃靜置6 h，使HA沉淀。10 000 r/min離心5 min，除去上清；加入與發(fā)酵液等體積的去離子水，充分溶解，將醇沉和溶解操作重復(fù)2遍。分離純化得到的樣品將用于測定HA的濃度和分子量。

1.3.5 透明質(zhì)酸寡糖含量測定

采用Bitter-Muir氏法定量測定HA含量[30]。

1.3.6 透明質(zhì)酸寡糖的分子量

采用高效液相色譜-體積排阻色譜 (HPSECMALLS-RI) 測定透明質(zhì)酸寡糖的質(zhì)量平均分子量 (Mw)、數(shù)量平均分子量 (Mn) 和多分散性系數(shù)Ip(Ip=Mw/Mn)[30]。

1.3.7 水蛭透明質(zhì)酸酶活力的測定方法

水蛭透明質(zhì)酸酶的活力單位定義為：在pH 5.5和38 ℃下，每小時(shí)從透明質(zhì)酸中釋放1 μg葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖所需的酶量[30]。LHAase的活力測定方法采用DNS法[30]。

1.3.8 LHAase的純化及質(zhì)譜檢測LHAase水解液中的HA寡糖

LHAase的N端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，純化LHAase蛋白時(shí)使用Ni-NTA親和柱富集高度濃縮發(fā)酵液上清的H6LHyal[33]。以滅活的H6LHyal純化液為對照，在38 ℃、pH 5.5的檸檬酸鹽緩沖液中，用H6LHyal純化液水解上述HA純化樣品15 h，水解液用含有ESI離子源C18柱 (150 mm×2.0 mm；Shimadzu，Kyoto，Japan) 的質(zhì)譜儀檢測[33]。流動相為水和乙腈，恒定流速0.2 mL/min。質(zhì)譜分析以負(fù)離子模式進(jìn)行，掃描范圍為300-1 500 (m/z)，10 s/scan。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)系統(tǒng)與重組獸疫鏈球菌的構(gòu)建

以質(zhì)粒pAX01-hasA和pMA05-sp-H6LHyal為模板，分別以引物hasA-F/hasA-R、H6(1)LHyal-F/H6(1)LHyal-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到hasA、H6LHyal的線性DNA片段分別與骨架pNZ8148(以質(zhì)粒pNZ8148為模板，使用引物PNZ-F/PNZ-R擴(kuò)增) 進(jìn)行組裝獲得重組質(zhì)粒pNZ8148-hasA和pNZ8148-H6LHyal。以引物H6(1)-ha-F/hasA-R對質(zhì)粒pAX01-hasA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的hasA線性DNA片段和骨架pNZ8148-H6LHyal(以質(zhì)粒pNZ8148-H6LHyal為模板，使用引物PNZ-F/H6(1)-ha-R擴(kuò)增) 進(jìn)行組裝獲得重組質(zhì)粒pNZ8148-H6LHyal-hasA。以引物Ha-h6(1)-F/hasA-R對質(zhì)粒pMA05-sp-H6LHyal進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的H6LHyal線性DNA片段與骨架pNZ8148-hasA(以質(zhì)粒pNZ8148-hasA為模板，使用引物PNZ-F/Hah6(1)-R擴(kuò)增) 進(jìn)行組裝獲得重組質(zhì)粒pNZ8148-hasA-H6LHyal。將質(zhì)粒pNZ8148、pNZ8148-hasA、pNZ8148-H6LHyal、pNZ8148-H6LHyal-hasA、pNZ8148-hasA-H6LHyal分別電轉(zhuǎn)入獸疫鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞，得到重組獸疫鏈球菌SZpnz、SZha、SZh6、SZh6(1)ha、SZhah6 (重組菌的菌落PCR驗(yàn)證見圖2)。H6LHyal RBS序列優(yōu)化以重組質(zhì)粒pNZ8148-H6LHyal-hasA為模板，使用引物H6(2)-ha-F/H6(2)-ha-R、H6(3)-ha-F/H6(3)-ha-R、H6(4)-ha-F/H6(4)-ha-R、H6(5)-ha-F/H6(5)-ha-R、H6-ha-F/H6-ha-R分別進(jìn)行全質(zhì)粒PCR，用Dpn1消化后獲得5個(gè)H6LHyal基因RBS強(qiáng)度不同的重組質(zhì)粒pNZ8148-H6LHyal-hasA，再將這5個(gè)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入獸疫鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞，得到重組獸疫鏈球菌SZh6(2)ha、SZh6(3)ha、SZh6(4)ha、SZh6(5)ha和SZh6ha。

圖2 重組菌菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 Colony PCR validation of recombinant strains.N：negative control;1,2：positive clone PCR amplification band (The size of hasA DNA fragment：1 254 bp;the size of H6LHyal DNA fragment：1 491 bp).(A) Recombinant strain SZha.(B) Recombinant strain SZh6.(C) Recombinant strain SZh6ha.(D) Recombinant strain SZhah6.

2.2 過表達(dá)hasA基因?qū)A產(chǎn)量的影響

將重組獸疫鏈球菌SZha在不同乳酸鏈球菌素終濃度下?lián)u瓶發(fā)酵，結(jié)果見圖3，在乳酸鏈球菌素終濃度小于40 ng/mL時(shí)，乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)過表達(dá)HasA使HA產(chǎn)量提高，同時(shí)乳酸鏈球菌素沒有對菌體生長帶來明顯的負(fù)面影響，菌體密度與對照 (乳酸鏈球菌素終濃度為0) 比相差不大。乳酸鏈球菌素終濃度大于40 ng/mL時(shí)，導(dǎo)致菌體密度與HA產(chǎn)量都減少了，這可能是高乳酸鏈球菌素濃度對細(xì)胞有毒性和對細(xì)菌生長有抑制作用的結(jié)果。當(dāng)乳酸鏈球菌素終濃度為40 ng/mL時(shí)，HA產(chǎn)量達(dá)到最大，比對照提高64.9%。說明在適合乳酸鏈球菌素濃度下過表達(dá)HasA能顯著提高HA產(chǎn)量。HasA利用兩種糖底物 (UDP-GlcA和UDP-GlcNAc) 合成HA，是HA生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶[3]。Chen等在獸疫鏈球菌中過表達(dá)HA合成操縱子的5個(gè)基因探究前體物濃度對HA產(chǎn)量及分子量影響，其研究結(jié)果也表明HasA的過表達(dá)導(dǎo)致HA產(chǎn)量的顯著增加和分子量的顯著降低[34]。

圖3 乳酸鏈球菌素添加量對菌體密度、透明質(zhì)酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of nisin addition on strain density and hyaluronan production.

2.3 LHAase的分泌表達(dá)及優(yōu)化

水蛭型透明質(zhì)酸酶 (LHAase；EC.3.2.1.36) 專一作用于HA的β-1,3糖苷鍵，產(chǎn)生還原端為葡萄糖醛酸的四糖或者己糖。通過DNS法檢測LHyal水解HA產(chǎn)生的還原糖含量可以計(jì)算出它的酶活。借鑒于N-端融合6個(gè)His標(biāo)簽對LHyal基因在枯草芽孢桿菌168中的分泌表達(dá)有顯著影響的成功案例[30]，在LHyal的N-端也融合了6個(gè)His標(biāo)簽。以SZpnz為對照菌株，將重組菌SZh6、SZh6(1)ha和SZhah6進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。為避免培養(yǎng)基中還原糖的存在對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的負(fù)面影響，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源由葡萄糖換成蔗糖，發(fā)酵24 h時(shí)將發(fā)酵液上清稀釋適當(dāng)倍數(shù)與DNS試劑反應(yīng)，結(jié)果見圖4A，直觀反映了SZh6、SZhah6、SZh6(1)ha發(fā)酵液上清有還原糖生產(chǎn)，證明了H6LHyal在獸疫鏈球菌中能分泌表達(dá)，并能在體外催化透明質(zhì)酸水解而產(chǎn)生還原糖。酶活測定結(jié)果如圖4B所示，SZh6的酶活僅為5 859.3 U/mL，SZhah6、SZh6(1)ha的酶活比SZh6分別高9%、37.96%。SDS-PAGE分析重組菌的LHAase表達(dá)情況，結(jié)果見圖4C?？梢钥闯鲋亟M菌SZh6(1)ha表達(dá)的LHAase含量高一些，這可能是在獸疫鏈球菌中H6LHyal的C端串聯(lián)表達(dá)HasA更有助于LHAase表達(dá)的原因。SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)一步分析純化的LHAase，結(jié)果見圖4D，在分子量為58 kDa處有清晰條帶，進(jìn)一步證明了H6LHyal分泌表達(dá)。質(zhì)譜檢測LHAase純化液水解HA純化樣品的結(jié)果見圖4E和圖4F，檢測到HA2、HA4、HA6、HA10，進(jìn)一步證明了分泌表達(dá)的H6LHyal存在酶活。H6LHyal的表達(dá)量比較低，需進(jìn)一步優(yōu)化。核糖體結(jié)合位點(diǎn) (RBS) 是蛋白表達(dá)的重要調(diào)控元件之一，RBS強(qiáng)度顯著影響蛋白的表達(dá)水平[30]。根據(jù)金鵬等[30]具有正結(jié)果的RBS序列及表達(dá)載體pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150所用的RBS序列進(jìn)行H6LHyal RBS序列優(yōu)化，結(jié)果見表2 (帶有下劃線的核苷酸序列為RBS序列)。優(yōu)化H6LHyal RBS序列的結(jié)果如圖4G所示。SZh6ha的酶活高達(dá)11 113.2 U/mL，比SZh6的酶活提高了89.67%。

圖4 LHAase的分泌表達(dá)及優(yōu)化Fig.4 Secretory expression and optimization of LHAase.(A) The LHAase activity of the recombinant strain by DNS method in the fermentation broth.(B) Recombinant LHAase activity detection.(C) SDS-PAGE analysis of LHAase by recombinant strains.1：SZpnz;2：SZh6;3：SZh6(1)ha;4：SZhah6;M：protein marker.(D) SDS-PAGE analysis of purified H6LHyal.1：SZh6(1)ha;2：SZh6;3：SZhah6.(E) Mass spectrometric analysis of H6LHyal (inactivated)hydrolysate.(F) Mass spectrometry analysis of H6LHyal hydrolysate.{The anion m/z of 396.11 [M-H]-(HA2),775.22[M-H]-(HA4),1154.33 [M-H]-(HA6),576.66 [M-H]2-(HA6),766.22 [M-H]2-(HA8)和955.77 [M-H]2-(HA10)}.(G) The enzyme activity analysis of LHAase by RBS sequence optimization.

2.4 透明質(zhì)酸寡糖一步發(fā)酵合成

圖5 搖瓶培養(yǎng)比較分析重組菌株和野生獸疫鏈球菌株Fig.5 The comparison of shake flask cultures of recombinant Streptococcus zooepidemicus and the wild-type strain.

將獸疫鏈球菌重組菌株SZpnz、SZha、SZh6、SZhah6、SZh6ha與野生菌株WT進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，第24小時(shí)的HA產(chǎn)量結(jié)果如圖5所示，帶有空載體pNZ8148的重組菌SZpnz的HA產(chǎn)量略微高于野生菌。其原因是外源質(zhì)粒帶來的應(yīng)激效應(yīng)有利于HA產(chǎn)量提高，但不顯著[34]。相對于野生菌株，重組菌SZha、SZh6的HA產(chǎn)量明顯提高，分別提高了72.0%和83.4%。hasA的過表達(dá)，導(dǎo)致更多透明質(zhì)酸合酶競爭前體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAcHA，使HA分子量顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致HA產(chǎn)量的顯著增加[34]。搖瓶發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵液粘稠度上升導(dǎo)致溶氧降低，嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常代謝和HA產(chǎn)量的提高[30]，而LHAase的分泌表達(dá)使得重組菌在產(chǎn)HA的同時(shí)也能對HA進(jìn)行降解，有效緩解發(fā)酵過程的溶氧問題，有益于HA產(chǎn)量提高。相比于野生菌，重組菌SZhah6、SZh6ha的HA產(chǎn)量分別提高了94.8%和182.0%。由于搖瓶發(fā)酵不能對pH值、溶氧、碳源濃度等發(fā)酵條件進(jìn)行有效控制，導(dǎo)致菌體密度低，HA產(chǎn)量低。因此，根據(jù)搖瓶發(fā)酵的結(jié)果，以野生菌株作為對照，將重組菌SZh6ha在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大發(fā)酵，結(jié)果如圖6所示。重組菌SZh6ha培養(yǎng)12 h就開始進(jìn)入穩(wěn)定期，野生菌培養(yǎng)16 h才進(jìn)入穩(wěn)定期，重組菌的菌體濃度一直低于野生菌，這可能與重組菌表達(dá)LHAase和過表達(dá)HasA對細(xì)胞生長造成壓力有關(guān)。發(fā)酵培養(yǎng)前8 h，HA積累量少，生長對數(shù)期的中后期，HA開始快速積累，細(xì)菌生長的穩(wěn)定期HA 依然在積累。發(fā)酵24 h時(shí)重組菌SZh6ha的HA積累量約為7.06 g/L，是搖瓶發(fā)酵水平的7.25倍，相比于野生菌的3 L發(fā)酵罐水平提高了112.4%；生產(chǎn)強(qiáng)度為294.2 mg/(L·h)，比已報(bào)道的重組枯草芽孢桿菌[30]的生產(chǎn)強(qiáng)度大；HAMw約為7.22×104Da (表3)，相對于野生菌的HAMw，有了大幅度的下降；Ip值約為1.31，說明重組菌SZh6ha在發(fā)酵時(shí)較好地保持了相對集中的分子量。在獸疫鏈球菌中表達(dá)LHAase和過表達(dá)HasA能提高碳通量流向透明質(zhì)酸合成途徑，最終達(dá)到提高透明質(zhì)酸寡糖產(chǎn)量的目的，在透明質(zhì)酸寡糖生產(chǎn)方面具有明顯的優(yōu)勢。

圖6 3 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵比較分析重組菌株和野生獸疫鏈球菌株Fig.6 The comparison of batch fermentation of recombinant Streptococcus zooepidemicus and the wild-type strain.

表3 重組獸疫鏈球菌株的透明質(zhì)酸分子量分析Table 3 The analysis of hyaluronan molecular weights of recombinant Streptococcus zooepidemicus strains

3 結(jié)論

透明質(zhì)酸寡糖在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景，構(gòu)建重組獸疫鏈球菌發(fā)酵合成透明質(zhì)酸寡糖具有重要意義。通過在獸疫鏈球菌WSH-24中過表達(dá)nisA 啟動子控制下的HasA，并優(yōu)化在80 g/L葡萄糖濃度下誘導(dǎo)劑乳酸鏈球菌素的用量，確定乳酸鏈球菌素終濃度為40 ng/mL時(shí)，乳酸鏈球菌素對細(xì)胞生長副作用較低，同時(shí)HA積累量達(dá)到最大，比對照提高64.9%。通過LHAase的N-端融合6個(gè)His標(biāo)簽和RBS序列優(yōu)化策略，實(shí)現(xiàn)LHAase在獸疫鏈球菌中分泌表達(dá)，重組菌的LHAase最高酶活高達(dá)11 113.2 U/mL。通過同時(shí)過表達(dá)HasA和優(yōu)化表達(dá)水蛭來源的LHAase，解決了發(fā)酵過程的溶氧問題并實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸寡糖的高效發(fā)酵合成。重組菌株搖瓶發(fā)酵24 h，HA積累至0.97 g/L，比野生菌提高了182.0%。在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵24 h，HA積累至7.06 g/L，比野生菌的罐上水平提高了112.4%；生產(chǎn)強(qiáng)度為294.2 mg/(L·h)，與已報(bào)道的重組枯草芽孢桿菌相比[30]，本研究所構(gòu)建的重組獸疫鏈球菌具有更大的生產(chǎn)強(qiáng)度。本研究為透明質(zhì)酸寡糖生物合成提供了新策略，在HA寡糖生產(chǎn)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。