絲狀真菌液體深層發(fā)酵過(guò)程菌絲聚集的調(diào)控機(jī)制

劉瑞桑，湯亞杰，白鳳武

1 大連理工大學(xué) 環(huán)境與生命學(xué)院，遼寧 大連 116024

2 湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430068

3 上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240

絲狀真菌 (Filamentous fungi) 是微生物發(fā)酵產(chǎn)品的重要表達(dá)體系[1]。絲狀真菌屬于多細(xì)胞微生物，形態(tài)上的多樣性遠(yuǎn)復(fù)雜于單細(xì)胞的細(xì)菌或酵母菌。液體深層發(fā)酵過(guò)程中絲狀真菌呈現(xiàn)絲狀(Filamentous form) 或球狀 (Pellet form)，絲狀又分為自由散絲 (Mycelium) 和菌絲聚集體 (Clump)，球狀又分為表面粗糙型 (Rough pellet) 和表面光滑型 (Smooth pellet)[1-2]。絲狀真菌液體深層發(fā)酵過(guò)程的典型特征是發(fā)酵環(huán)境影響菌絲聚集，菌絲聚集影響發(fā)酵體系流變特性，流變特性影響傳質(zhì)、傳熱、傳動(dòng)，從而影響目標(biāo)產(chǎn)物生物合成和發(fā)酵過(guò)程效率 (圖1)[3]。一方面，同一種絲狀真菌在不同的形態(tài)下可以生產(chǎn)完全不同的產(chǎn)品。以黑曲霉Aspergillus niger為例[4]，菌絲纏繞形成大小適宜的致密菌球后，發(fā)酵產(chǎn)品是檸檬酸；而自由散絲則高產(chǎn)淀粉酶。另一方面，絲狀菌體纏繞在感應(yīng)電極 (如溫度電極、pH電極、溶氧電極等) 上影響發(fā)酵參數(shù)的讀取，誤導(dǎo)發(fā)酵過(guò)程的控制，將對(duì)生產(chǎn)造成不可逆轉(zhuǎn)的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。當(dāng)菌絲聚集形成菌球后導(dǎo)致培養(yǎng)體系從高粘度非牛頓型流體向低粘度近牛頓型流體轉(zhuǎn)變，有利于生物反應(yīng)器工程水平上的傳質(zhì)、傳熱、傳動(dòng)，從而有利于產(chǎn)物合成[1-2]。因此，調(diào)控菌絲聚集對(duì)絲狀真菌液體深層發(fā)酵過(guò)程具有重要意義[1-2]。文中首先綜述了絲狀真菌形態(tài)調(diào)控過(guò)程常用的方法和策略，然后針對(duì)絲狀真菌頂端延伸生長(zhǎng)和分枝生長(zhǎng)綜述了鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑和幾丁質(zhì)生物合成途徑對(duì)調(diào)控菌體聚集這一形態(tài)的重要意義。

圖1 絲狀真菌液體深層發(fā)酵菌體形態(tài)的影響Fig.1 Significance of mycelium aggregation during filamentous fungi submerged fermentation.

1 形態(tài)表征

要對(duì)絲狀真菌形態(tài)進(jìn)行調(diào)控，就必須對(duì)形態(tài)進(jìn)行定性和定量表征。將圖像分析技術(shù)運(yùn)用于絲狀真菌形態(tài)學(xué)，對(duì)菌體大小和形狀進(jìn)行定量表征，是認(rèn)識(shí)研究菌體形態(tài)特征的一個(gè)有力工具[7-9]。獲取菌體形態(tài)照片后，通過(guò)電子圖像二值化，使分析對(duì)象與背景及其他雜質(zhì)能夠明顯區(qū)分開來(lái)，然后對(duì)二值圖進(jìn)行修正除雜后用于菌體形態(tài)的定性和定量分析[7-9]。通過(guò)定義8個(gè)特征參數(shù) (如平均灰度、灰度的標(biāo)準(zhǔn)偏差、面積、圓度因子、周長(zhǎng)、形態(tài)因子α、β和OP等)，運(yùn)用模式識(shí)別對(duì)絲狀菌體形態(tài) (Pellet aggregates，rough pellets，smooth pellets，mycelia flocks) 進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別分類，準(zhǔn)確率達(dá)到了98%[10]。此后，利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[11]、形態(tài)學(xué)參數(shù)過(guò)濾器[12]等圖像分析手段可以提高圖像分析的快捷性和準(zhǔn)確性。然而，由于區(qū)分菌體形態(tài)種類的邊界條件難以界定，菌體形態(tài)定性分類相對(duì)困難；此外，在定量分析方面亦無(wú)一定的標(biāo)準(zhǔn)，主觀因素可能帶來(lái)更多的誤差。

2 形態(tài)代謝工程與形態(tài)基因挖掘

形態(tài)工程 (Morphology engineering) 對(duì)絲狀真菌液體深層發(fā)酵過(guò)程的重要性已經(jīng)被廣泛認(rèn)可?？茖W(xué)家們通過(guò)改變發(fā)酵環(huán)境變量 (如培養(yǎng)基成分、pH、剪切、溶氧、CO2濃度、滲透壓等)[13-15]和添加微粒促進(jìn)劑 (Microparticle-enhanced cultivation，如硅酸鹽、硅氧化物、金屬鈦氧化物等)[16-17]來(lái)研究菌體形態(tài)形成規(guī)律，關(guān)聯(lián)菌體形態(tài)與目標(biāo)產(chǎn)物合成的關(guān)系，獲得發(fā)酵環(huán)境變量、菌體形態(tài)以及產(chǎn)物合成之間的相互關(guān)系。國(guó)際代謝工程領(lǐng)域的權(quán)威Jens Nielsen教授率先在分子水平研究絲狀真菌培養(yǎng)過(guò)程菌絲纏繞聚集對(duì)代謝途徑和目標(biāo)產(chǎn)物合成的影響，開創(chuàng)了形態(tài)代謝工程(Metabolic engineering of morphology)[18-19]。由基因chsB編碼合成的幾丁質(zhì)合成酶B是野生型米曲霉Aspergillus oryzae菌絲正常生長(zhǎng)分泌α-淀粉酶所必需的，然而野生型的A.oryzae在液體深層發(fā)酵過(guò)程中菌絲聚集形成不規(guī)則的團(tuán)狀菌體，不利于發(fā)酵過(guò)程控制[20-22]。Nielsen課題組運(yùn)用代謝工程手段，阻斷了編碼幾丁質(zhì)合成酶B的基因chsB，發(fā)現(xiàn)改造后的A.oryzae菌絲頂端生長(zhǎng)速率比野生型慢88%，菌絲分叉頻率卻提高了188%；并且在液體深層發(fā)酵過(guò)程中改造后的A.oryzae菌絲沒(méi)有聚集成團(tuán)狀菌體，雖然產(chǎn)物α-淀粉酶產(chǎn)量沒(méi)有增加，但卻有利于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的控制[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)基因chsB表達(dá)水平受“氮源-調(diào)節(jié)啟動(dòng)子”NiiA1影響[19]。這說(shuō)明通過(guò)控制發(fā)酵環(huán)境可以調(diào)節(jié)chsB基因表達(dá)水平，進(jìn)而影響A.oryzae菌絲分枝頻率，有望提高目標(biāo)產(chǎn)物生物合成。Nielsen課題組為深入分子水平理解菌絲聚集和目標(biāo)產(chǎn)物代謝途徑之間的關(guān)系進(jìn)行了有益探索。在產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum中，Ⅲ類幾丁質(zhì)合成酶基因chs4(與曲霉chsB序列一致性高)的沉默表達(dá)顯著改變菌絲體形態(tài)，形成分枝多、易結(jié)球的形態(tài)，chs4靜默表達(dá)篩選得到的兩突變株，其目標(biāo)產(chǎn)物青霉素產(chǎn)量比野生型分別提高了27%和41%[23]。

形態(tài)代謝工程的典型策略是通過(guò)實(shí)現(xiàn)形態(tài)基因表達(dá)水平的調(diào)控，進(jìn)而影響絲狀真菌形態(tài)發(fā)育，最終獲得利于目標(biāo)產(chǎn)物生物合成的菌體形態(tài)。而該策略中最為關(guān)鍵的是篩選形態(tài)基因，絲狀真菌液體深層發(fā)酵過(guò)程中菌體形態(tài)對(duì)產(chǎn)物合成的影響，在分子水平上其本質(zhì)是基因組中相關(guān)基因差異表達(dá)對(duì)細(xì)胞群體生理和代謝功能的影響。篩選出具有調(diào)控菌絲聚集功能的調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)水平去影響菌絲聚集[23]。差異表達(dá)基因篩選技術(shù)是快速獲得目標(biāo)功能基因的有效途徑。抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH) 具有假陽(yáng)性率低、敏感性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于差異表達(dá)基因的篩選。SSH通過(guò)兩次差減雜交使目的基因得以富集，在差減雜交過(guò)程中采用了基因表達(dá)豐度均一化與抑制PCR技術(shù)，使得低豐度的目標(biāo)基因也可被獲得，而非目標(biāo)基因的擴(kuò)增得到抑制[24]。SSH不僅提高了基因克隆的效率，而且可同時(shí)分離上百個(gè)不論高低豐度的差異表達(dá)基因。在靈芝Ganoderma lucidum液體深層發(fā)酵過(guò)程中，振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)導(dǎo)致了菌體形態(tài)明顯不同，前者菌絲聚集形成菌球，后者則分化形成了無(wú)性孢子。通過(guò)SSH技術(shù)構(gòu)建了不同菌體形態(tài)的消減差異雜交文庫(kù)，從601個(gè)差異表達(dá)基因中篩選到了調(diào)控菌絲聚集的10多個(gè)關(guān)鍵基因，如靈芝GR367308、GR367360、GR367378和GR367405等[25]。黑曲霉A.niger液體深層發(fā)酵過(guò)程中菌球的形成強(qiáng)化了目標(biāo)產(chǎn)物檸檬酸的生物合成。通過(guò)SSH技術(shù)篩選到了22個(gè)與A.niger菌體形態(tài)發(fā)育相關(guān)的基因，并且這些基因的表達(dá)水平受到Mn2+濃度的調(diào)控：1 000 μg/L Mn2+時(shí)，15個(gè)基因表達(dá)并調(diào)控菌絲聚集形成絲狀；10 μg/L Mn2+時(shí)，7個(gè)基因表達(dá)并調(diào)控菌絲聚集形成菌球[23]。因此，運(yùn)用SSH技術(shù)可以高效篩選到調(diào)控菌絲聚集引起菌體形態(tài)變化的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，為后續(xù)深入研究這些差異基因的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

科學(xué)家們已經(jīng)陸續(xù)篩選到了調(diào)控菌絲聚集的相關(guān)基因，如調(diào)控米曲霉A.oryzae菌絲頂端生長(zhǎng)速率和菌絲分枝頻率的chsB[19]、與靈芝G.lucidum菌絲聚集形成菌球或是分化形成無(wú)性孢子的GR367308等10多個(gè)基因[25]、與黑曲霉A.niger菌體形態(tài)發(fā)育相關(guān)的22個(gè)基因[23]。在構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans中，分離鑒定了至少6個(gè)形態(tài)基因：hypA/podA與保持菌絲極性生長(zhǎng)密切相關(guān)，失活該基因菌絲變寬且細(xì)胞壁變厚[24-25]；hypC控制細(xì)胞尺寸和隔膜的分割，該基因失活后頂體細(xì)胞變短，分叉頻率變高[24]；podB與菌絲極性生長(zhǎng)和頂端細(xì)胞骨架組成密切相關(guān)，失活該基因菌絲膨脹[25]；sepA控制激動(dòng)蛋白微絲在細(xì)胞壁的定位，失活該基因菌絲變寬，分叉頻率增加[26]；swoA和swoF與菌絲體極性生長(zhǎng)相關(guān)，且各自基因失活后菌體膨脹[27]。

但是，在液體深層發(fā)酵過(guò)程中，如何通過(guò)控制發(fā)酵環(huán)境影響這些形態(tài)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控菌絲聚集，最終強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物合成的研究則未見相關(guān)報(bào)道。

3 頂端延伸與分枝生長(zhǎng)

絲狀真菌在極性生長(zhǎng)的過(guò)程中，多種細(xì)胞骨架成分 (包括微絲、微管和中間纖維)、蛋白質(zhì)、脂類、細(xì)胞器、信號(hào)分子以及能量分子都會(huì)參與，絲狀真菌主要由運(yùn)輸?shù)鞍滓约昂泻铣杉?xì)胞壁所需物質(zhì)的分泌小泡沿著細(xì)胞骨架中的微管運(yùn)輸至頂體。頂體菌絲體尖端具有豐富囊泡的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部含有各種囊泡、核糖體、不同的功能酶等。頂體在細(xì)胞的延伸與分枝的形成過(guò)程中決定細(xì)胞生長(zhǎng)的中心及方向，同時(shí)也是組成微管和微絲肌動(dòng)蛋白囊泡的轉(zhuǎn)換站。囊泡以水泡狀形態(tài)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，再濃縮加工釋放，使頂端質(zhì)膜增加。同時(shí)，頂端的囊泡內(nèi)含物也被運(yùn)到細(xì)胞壁附近，這些內(nèi)含物包括了細(xì)胞壁的溶解酶類、合成酶類以及一些細(xì)胞壁合成前體物質(zhì)。溶壁酶破去原細(xì)胞壁間的化學(xué)鍵，頂體在壁合成酶的作用下進(jìn)入細(xì)胞壁中，從而使質(zhì)膜增大、細(xì)胞壁增加、菌絲生長(zhǎng) (圖2)[28]。

絲狀真菌形態(tài)發(fā)育過(guò)程是高度極化生長(zhǎng)的過(guò)程。頂端延伸生長(zhǎng)和分枝生長(zhǎng)是絲狀真菌形態(tài)發(fā)育的兩大特征。頂端延伸生長(zhǎng)被認(rèn)為是“細(xì)胞壁水解”、“新細(xì)胞壁合成”和“細(xì)胞壁膨壓”三者之間的動(dòng)力平衡。菌絲進(jìn)行頂端延伸生長(zhǎng)后通過(guò)不斷的分枝生長(zhǎng)形成新的菌絲，進(jìn)而通過(guò)“網(wǎng)結(jié)現(xiàn)象”聚集在一起形成菌絲體。菌絲體的頂端延伸離不開胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)和細(xì)胞壁主要成分幾丁質(zhì)的生物合成。因此，鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑和幾丁質(zhì)生物合成途徑對(duì)絲狀真菌形態(tài)調(diào)節(jié)具有重要意義。

圖2 絲狀真菌頂端生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的分布圖[28]Fig.2 Overview of a hypothetical hyphal apex displaying some of the major components participating in tip growth[28].The polarity machinery maintains sites of growth by activating a set of cascade pathways that lead to polymerization of the actin cytoskeleton.Vesicles move along microtubules or actin cables until they reach the Spitzenk?rper.From there they are delivered to the apical plasma membrane.

3.1 鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑與形態(tài)發(fā)育

Ca2+信號(hào)通路廣泛存在于真核生物細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)的菌絲頂端，其細(xì)胞內(nèi)都會(huì)形成較高的鈣離子濃度，尤其在分枝生長(zhǎng)出現(xiàn)的前期，而菌絲沒(méi)有生長(zhǎng)的頂端卻不存在這種現(xiàn)象。這預(yù)示著在頂端細(xì)胞存在較高的Ca2+濃度是菌絲生長(zhǎng)所必需的。因此，擾動(dòng)胞外環(huán)境中的Ca2+濃度，能影響菌絲頂端延伸和分枝生長(zhǎng)模式，進(jìn)而最終影響到菌絲體形態(tài)[29]。

一般，細(xì)胞外鈣離子濃度是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的數(shù)千倍。在鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑中 (圖3)，當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞膜上的鈣離子通道被激活，胞外鈣離子流入胞內(nèi)。與此同時(shí)，胞內(nèi)鈣離子亦可通過(guò)胞內(nèi)鈣庫(kù) (如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和液泡等) 在胞內(nèi)獲得補(bǔ)充。一旦胞內(nèi)鈣離子濃度增加的信號(hào)被鈣調(diào)蛋白 (Calmodulin，CaM) 感知，將形成Ca2+/鈣調(diào)蛋白復(fù)合物 (Ca2+/CaM)。隨后，Ca2+/CaM激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶 (Calcineurin)中的調(diào)節(jié)亞基CnB，繼續(xù)作用于具有去磷酸化功能的催化亞基CnA，促使轉(zhuǎn)錄因子CRZ (Calcineurinresponsive zinc finger transcription factor，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶響應(yīng)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子) 去磷酸化。去磷酸化后的CRZ進(jìn)入到細(xì)胞核中與CDRE(Calcineurin-depdent response element，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶依賴型響應(yīng)元件) 基因 (如鈣泵編碼基因或其他脅迫應(yīng)激基因等) 的啟動(dòng)子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)下游基因的調(diào)控作用[30-32]。

通過(guò)對(duì)鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控 (圖3)，是探索該途徑與表型關(guān)系的主要方法。一方面，通過(guò)外源添加抑制劑可以間接調(diào)控胞內(nèi)鈣離子濃度。這些抑制劑主要是指能夠與胞內(nèi)鈣離子濃度變化起響應(yīng)的元件——鈣調(diào)蛋白或鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶的抑制劑。如吩噻嗪鹽酸鹽CPZ(Chlorpromazine hydrochloride)[33]，其能夠抑制鈣調(diào)蛋白的活性；親脂性環(huán)狀多肽化合物環(huán)孢菌素CsA (Cyclosporin A)[34]和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素FK506 (Tacrolimus)[35]是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶的抑制劑。其中，F(xiàn)K506和CsA進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)與其各自的配體結(jié)合以后形成的二元復(fù)合物可以與Calcineurin的調(diào)節(jié)亞基CnB的活性位點(diǎn)結(jié)合，從而影響催化亞基CnA的生物活性。本課題組在研究粉紅粘帚霉Clonostachys rosea液體深層發(fā)酵過(guò)程中菌絲聚集，外源添加FK506可以使菌絲體內(nèi)的鈣離子濃度明顯增加，且最終形成更多的菌球形態(tài)。另一方面，通過(guò)靜默/敲除或者過(guò)表達(dá)CRZ研究其與下游基因的相互關(guān)系成為理解鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑與表型 (比如形態(tài)發(fā)育、抗逆性等)的紐帶。

圖3 真菌細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑[30]Fig.3 Calcium signal transduction pathway in fungal cells[30].CaM：calmoduline;CN：calcineurin;ER：endoplasmic reticulum;LACS：low-affinity Ca2+ influx system;HACS：high-affinity Ca2+ influx system.

轉(zhuǎn)錄因子CRZ是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCRZ1的同源蛋白，是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶下游的主要元件，包含1個(gè)C2H2鋅指基序，用于結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域含有CDRE基序的基因[31]。其經(jīng)過(guò)去磷酸化后，能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與調(diào)控含有CDRE基序的基因表達(dá)[32]。目前，CRZ研究主要聚焦于模式絲狀真菌和致病菌。如構(gòu)巢曲霉A.nidulans轉(zhuǎn)錄因子crzA基因能夠調(diào)控Ca2+/H+離子交換基因的表達(dá)，調(diào)控胞內(nèi)鈣離子濃度的平衡[30]；致病菌新生隱球菌Cryptococcus neoformans缺失同源蛋白CRZ1后，細(xì)胞壁的完整性降低，且?guī)锥≠|(zhì)合成酶Chs6的表達(dá)量明顯降低[36]。

鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑中CRZ作為轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控下游基因 (如形態(tài)基因) 影響菌絲聚集模式，最終影響菌絲形態(tài)。

3.2 幾丁質(zhì)生物合成途徑與菌體形態(tài)發(fā)育

對(duì)于絲狀真菌，細(xì)胞壁是決定其形態(tài)的重要因素。幾丁質(zhì)作為真菌細(xì)胞壁的主要成分，在決定頂端生長(zhǎng)、分枝以及細(xì)胞壁分化等形態(tài)變化的相關(guān)過(guò)程中處于核心地位。因此，幾丁質(zhì)生物合成過(guò)程勢(shì)必會(huì)影響菌絲生長(zhǎng)。

在幾丁質(zhì)生物合成過(guò)程中，其關(guān)鍵酶是幾丁質(zhì)合成酶。幾丁質(zhì)合成酶存在于殼質(zhì)體 (Chitosome)內(nèi)。殼質(zhì)體是一種特殊的微管，含有非活化態(tài)的幾丁質(zhì)合成酶。幾丁質(zhì)合成酶被殼質(zhì)體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，進(jìn)而合成幾丁質(zhì)微纖絲[28]。幾丁質(zhì)合成酶是一種跨膜蛋白質(zhì)，需要在磷脂環(huán)境中活動(dòng)，并且從細(xì)胞質(zhì)中吸收底物來(lái)合成幾丁質(zhì)的初生鏈，并供給細(xì)胞壁進(jìn)行生長(zhǎng)。這個(gè)過(guò)程中，幾丁質(zhì)合成酶需要二價(jià)金屬離子來(lái)激活。研究表明，氚標(biāo)記的乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc) 與幾丁質(zhì)的結(jié)合在菌絲頂端是高度極性化的，它只與菌絲頂端的細(xì)胞壁結(jié)合，很少結(jié)合在周邊的壁上。遺傳證據(jù)表明，幾丁質(zhì)合成酶需要復(fù)合蛋白來(lái)把它們定位到細(xì)胞膜的適當(dāng)位置上。在活細(xì)胞中，正是殼質(zhì)體運(yùn)送幾丁質(zhì)合成酶與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合后，這時(shí)酶原被激活，利用底物GlcNAc-UDP合成細(xì)胞壁的必需成分幾丁質(zhì)[37-38]。尼可霉素 (Nikkomycins)和多氧霉素 (Polyoxins) 是底物GlcNAc-UDP的結(jié)構(gòu)類似物。茴香腦 (反式茴香腦，茴香烯) 是從茴香油 (俗稱八角油) 分離得到，并且通過(guò)結(jié)合幾丁質(zhì)合成酶的活性部位而抑制其酶活性[39]。

根據(jù)幾丁質(zhì)合成酶氨基酸序列的相似性和差異性，幾丁質(zhì)合成酶在釀酒酵母中分為3大類，假絲酵母菌中分為4大類，而在絲狀真菌中則存在7大類，且不同絲狀真菌中存在的幾丁質(zhì)合成酶基因數(shù)目也不同[40]。如粗糙脈孢菌Neurospora crassa幾丁質(zhì)合成酶Chs1-7都發(fā)現(xiàn)存在于新生的隔膜和頂體 (Spitzenk?rper) 的中心，其中幾丁質(zhì)合成酶Chs6和Chs7對(duì)頂端延伸生長(zhǎng)和最終菌絲形態(tài)有明顯影響[41]；植物致病菌稻瘟病菌Magnaporthe oryzae中幾丁質(zhì)合成酶基因chs6缺失的突變株存在菌絲生長(zhǎng)減緩的現(xiàn)象[42]；產(chǎn)青黃霉菌P.chrysogenum中，幾丁質(zhì)合成酶基因chs4的沉默表達(dá)則使得發(fā)酵過(guò)程中松散的分散菌絲體聚集形成團(tuán)塊狀的菌球[23]。枸巢曲霉A.nidulans幾丁質(zhì)合成酶基因chsB的缺失導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)極度緩慢，并且形成菌絲高度分枝的小克隆 (Small colonies)[43]，而在煙曲霉Asepergillus fumigatus中敲除幾丁質(zhì)合成酶基因chsG后，菌體生長(zhǎng)形態(tài)與敲除chsB情況類似[44]?？梢?，幾丁質(zhì)合成酶因不同的絲狀真菌具有不同的形態(tài)發(fā)育調(diào)控功能。

3.3 鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑與幾丁質(zhì)合成途徑對(duì)菌絲聚集調(diào)控的分子機(jī)制

鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的轉(zhuǎn)錄因子CRZ通過(guò)與CDRE基因的啟動(dòng)子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)其對(duì)下游基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。因此，挖掘CRZ與形態(tài)基因 (如幾丁質(zhì)合成酶基因) 的結(jié)合位點(diǎn) (CDRE)，有望進(jìn)一步理解鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑與幾丁質(zhì)合成途徑對(duì)菌絲聚集調(diào)控的分子機(jī)制。從A.nidulans中篩選25個(gè)依賴于CrzA表達(dá)調(diào)控的基因，預(yù)測(cè)5′-G[T/G]GGC[T/A]G[T/G]G-3′為其結(jié)合位點(diǎn)，這與釀酒酵母S.cerevisiae中Crz1p的結(jié)合位點(diǎn)5′-GNGGC[G/T]CA-3′和5′-CGGTGGCTGTGC-3′類似。A.nidulans中轉(zhuǎn)錄因子Crz結(jié)合幾丁質(zhì)合成酶基因chsB啟動(dòng)區(qū)序列為GTGGCTC[45]。本課題組在研究粉紅粘帚霉C.rosea液體深層發(fā)酵過(guò)程中菌絲聚集的分子機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)CRZ對(duì)該菌的幾丁質(zhì)合成酶基因(chs1-6) 的啟動(dòng)子區(qū)都有一個(gè)相似的結(jié)合位點(diǎn)，并且調(diào)控了chs1-6的基因表達(dá)水平，進(jìn)而顯著影響到菌絲體形態(tài)發(fā)育。

綜上，如圖4所示，當(dāng)絲狀真菌受外界壓力時(shí) (如外源擾動(dòng)Ca2+或者添加抑制劑吩噻嗪鹽酸鹽CPZ、環(huán)孢菌素CsA、FK506等)，胞內(nèi) Ca2+濃度的瞬態(tài)漲落激發(fā)后續(xù)鈣信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Crz與下游幾丁質(zhì)合成酶基因chs的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，從而調(diào)控到幾丁質(zhì)的生物合成，最終影響菌絲聚集形態(tài)。

圖4 鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑與幾丁質(zhì)合成途徑調(diào)控菌絲聚集的作用機(jī)制Fig.4 Schematic representation of the crosstalk between calcium signaling pathways and chitin biosynthesis.

4 展望

絲狀真菌作為微生物發(fā)酵產(chǎn)品的重要表達(dá)體系，圍繞著其形態(tài)發(fā)育與調(diào)控，科學(xué)家們開展了過(guò)程工程調(diào)控策略研究和形態(tài)代謝工程研究。前者將菌絲聚集作為一個(gè)“黑箱”，后者需快速篩選到調(diào)控菌絲聚集的形態(tài)基因。如何將兩者進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)“發(fā)酵環(huán)境影響調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平、進(jìn)而調(diào)控菌絲聚集，最終強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物合成”的遞進(jìn)調(diào)控策略將是研究的最終落腳點(diǎn)。菌絲體延伸生長(zhǎng)和分叉生長(zhǎng)是絲狀真菌形態(tài)發(fā)育的兩大特征，其內(nèi)在的生理生化過(guò)程與鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑、幾丁質(zhì)生物合成途徑都密切相關(guān)。而菌體形態(tài)的形成和變遷，其本質(zhì)是分子水平相關(guān)基因差異表達(dá)，即調(diào)控菌絲聚集的調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平的差異。因此，后續(xù)深入解析絲狀真菌液體發(fā)酵過(guò)程中菌絲聚集的分子調(diào)控機(jī)制，從分子水平認(rèn)知絲狀真菌液體深層發(fā)酵菌體形態(tài)多樣化，將豐富對(duì)菌絲聚集的認(rèn)識(shí)，對(duì)正向調(diào)控菌絲聚集、強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物合成具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。