低氧耐力運動對營養(yǎng)性肥胖大鼠骨骼肌自噬蛋白表達的影響

趙芳芳 文根 吳菊花 李志剛 翁錫全 林文弢

1 廣州體育學院省重點生化實驗室（廣州510500）

2 吉林大學珠海學院

3 廣西科技大學體育學院

4 百色學院體育學院

自噬（Autophagy）作為真核生物體內(nèi)存在的自我保護機制，在機體能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，長期高脂飲食會抑制大鼠體內(nèi)自噬相關因子的活性[1]，而運動可激活機體的細胞自噬，并使細胞自噬相關因子的表達出現(xiàn)不同程度的提高[2，3]。除運動外，低氧亦可誘導自噬的發(fā)生，薄海等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧狀態(tài)下進行中等負荷有氧運動訓練，可提高骨骼肌線粒體ATP 輸出，抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，線粒體膜蛋白PTEN 誘導激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）、Parkin和Bcl-2/腺病毒E1B 19 k Da 結(jié)合蛋白（Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3）表達量顯著升高，提示低氧可顯著促進線粒體自噬增加。同樣，亦有研究表明，營養(yǎng)性肥胖大鼠在低氧條件下運動，其腓腸肌自噬相關因子P62、LC3、Beclin1的表達具有顯著性提高[5]。而運動或低氧作為防治肥胖的有效干預手段是如何調(diào)控細胞自噬，發(fā)揮防控代謝性疾病的作用，值得進一步探討。因此，本研究通過建立營養(yǎng)性肥胖大鼠模型，并對其進行不同濃度的低氧或結(jié)合耐力運動干預，探討在持續(xù)性高脂飲食的條件下，低氧、運動、低氧結(jié)合運動對骨骼肌細胞自噬相關蛋白微管相關蛋白1 輕鏈3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、酵母ATG6 同源物（Beclin1）、AMPKα2、Sestrin2 表達的影響，旨在為代謝性疾病的防治提供理論依據(jù)和實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 低氧耐力訓練模型

選取建模成功的營養(yǎng)性肥胖大鼠80只，按不同濃度的低氧分為安靜組和運動組（具體分組情況如表1），每組各10只，進行1周（第1～6天）常氧跑臺適應性訓練和1 周（第8～13 天）低氧結(jié)合耐力運動適應性訓練（大鼠適應期訓練方案見表2）。正式試驗干預期，大鼠訓練方案如下：運動組大鼠均進行中等強度耐力運動，其中時間為40 min，跑臺坡度為0，跑速為20 m/min；運動頻率為一周5次（每周一到周五），持續(xù)8周。其中，A組大鼠不進行任何干預，AE組大鼠進行常氧中等強度耐力訓練，B 組、C 組、D 組分別給予氧濃度為16.3%、13.3%、11.3%的低氧暴露（在相應的低氧環(huán)境下，每天進行連續(xù)12 h 低氧干預，干預時間為早8：00 到晚8點），其中BE組和CE 組、DE組大鼠分別給予氧濃度為16.3%、13.3%、11.3%的低氧暴露并增加中等強度耐力運動訓練（低氧暴露時間與低氧組相同，但在晚7點進行40 min的低氧耐力訓練）。

表1 低氧運動訓練大鼠分組情況（各組n=10）

表2 適應期運動方案

1.2 動物取材

末次低氧耐力訓練結(jié)束后，禁食24 小時，稱量大鼠體重并測體長，腹腔注射10%水合氯醛溶液（按0.3 ml/100 g體重劑量）進行大鼠麻醉，腹部解剖，取腓腸肌組織稱重，并取一側(cè)腓腸肌冰上勻漿抽提總蛋白，另一側(cè)腓腸肌置凍存管于液氮中速凍，隨后于－70℃超低溫冰箱保存，待測。

1.3 Western blot法測定骨骼肌自噬相關蛋白

骨骼肌總蛋白提取：電子天平稱取100 mg 腓腸肌并剪碎，放入1 ml RIPA 蛋白裂解液（碧云天）和10 μl PMSF 蛋白酶抑制劑（康為世紀）的混合液，于冰上研磨并裂解20 min；之后，低溫離心機以－4℃、12000 rpm離心15 min，上清液于1.5 mL的EP管存放。BCA 法測定蛋白濃度后與上樣緩沖液于沸水中煮5 min，使蛋白變性。15%、10%分離膠，5%濃縮膠電泳；采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5%脫脂牛奶封閉過夜；一抗（LC3、Beclin1、AMPKα2、Sestrin2 均購置美國ABCAM公司）、GAPDH（美國Proteintech Group公司）均用TBST緩沖液以1∶1000和1：8000稀釋，于4℃冰箱孵育過夜；二抗（Sera care 公司）以1∶5000 稀釋，室溫搖床孵育2 h。Western blot 結(jié)果使用Tanon（天能）5200 Multi 儀器自帶軟件進行灰度值分析，以目的蛋白/內(nèi)參值作為目的蛋白的半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗所得數(shù)據(jù)均以平均值±標準（x±s）表示，GraphPad Prism5進行數(shù)理統(tǒng)計及圖像生成，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腓腸肌細胞Sestrin2蛋白的表達情況

由圖1可知，實施低氧暴露干預后，與A組相比，C組、D 組Sestrin2 蛋白表達水平顯著性升高（P＜0.05），B組有上升趨勢；與B組相比，D組Sestrin2蛋白表達水平顯著性升高（P＜0.05）。實施耐力運動干預后，與安靜組大鼠相比，運動組大鼠腓腸肌Sestrin2蛋白表達均具有升高趨勢，其中AE 組與A 組、BE 組與B 組、DE 組與D組相比Sestrin2蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低氧結(jié)合耐力運動雙重干預后，與AE組相比，BE組、CE組Sestrin2蛋白表達有上升趨勢，DE組Sestrin2蛋白表達顯著性升高（P＜0.05）；與BE組、CE組相比，DE組Sestrin2蛋白表達顯著性升高（P＜0.05）。

圖1 低氧或結(jié)合耐力運動對肥胖大鼠腓腸肌細胞Sestrin2蛋白表達的影響

2.2 各組大鼠腓腸肌細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的變化情況

由圖2可知，實施低氧暴露干預后，與A組相比，C組、D組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著性升高（P＜0.05），B組具有上升趨勢；與B 組相比，D 組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著性升高（P＜0.05）。實施耐力運動干預后，與各安靜組大鼠相比，運動組大鼠腓腸肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著性升高（P＜0.05）。低氧結(jié)合耐力運動雙重干預后，與AE組相比，BE組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有上升趨勢，CE組、DE組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著性升高（P＜0.05）；與BE組相比，DE組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著性升高（P＜0.05）。

圖2 低氧或結(jié)合耐力運動對肥胖大鼠腓腸肌細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影響

2.3 各組大鼠腓腸肌細胞Beclin1蛋白表達情況

由圖3可知，實施低氧暴露干預后，與A組相比，B組、C組、D組Beclin1蛋白表達顯著升高（P＜0.05），與B組、C 組相比，D 組Beclin1 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。實施耐力運動干預后，與安靜組大鼠相比，運動組大鼠腓腸肌Beclin1 蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。低氧結(jié)合耐力運動雙重干預后，與AE組相比，BE組、CE組Beclin1蛋白表達具有上升趨勢，DE組Beclin1 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與BE、CE 組相比，DE組Beclin1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腓腸肌細胞AMPKα2蛋白表達情況

由圖4可知，實施低氧暴露干預后，與A組相比，C組、D 組AMPKα2 蛋白表達顯著性升高（P＜0.05）；與B組相比，C 組、D 組AMPKα2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。實施耐力運動干預后，與安靜組大鼠相比，運動組大鼠腓腸肌AMPKα2 蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。低氧結(jié)合耐力運動雙重干預后，與AE組相比，BE 組AMPKα2 蛋白表達具有上升趨勢，CE 組、DE 組AMPKα2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），與BE 組、CE 組相比，DE組AMPKα2蛋白表達顯著性升高（P＜0.05）。

圖3 低氧或結(jié)合耐力運動對肥胖大鼠腓腸肌細胞Beclin1蛋白表達的影響

圖4 低氧或結(jié)合耐力運動對肥胖大鼠腓腸肌細胞AMPKα2蛋白表達的影響

3 分析與討論

3.1 低氧或結(jié)合耐力運動對肥胖大鼠腓腸肌細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影響

LC3Ⅱ被認為是自噬活動的特異性標志物，通常用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值來衡量自噬活性，其比值下降提示自噬活性減弱，反之則說明自噬活性增強[6，7]。崔迪等[8]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠進行跑臺耐力訓練6周后，高脂對照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，普通膳食組、高脂運動組小鼠骨骼肌p62蛋白水平下降，高脂運動組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上調(diào)。本實驗結(jié)果與之一致，經(jīng)過8 周的低氧或結(jié)合耐力運動后，與常氧安靜組相比，常氧運動組、低氧組大鼠腓腸肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值具有升高趨勢，并且常氧運動組、13.3%低氧安靜組、11.3%低氧安靜組大鼠骨骼肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著性升高，說明耐力運動及低氧暴露可激活自噬。與常氧運動組相比，13.3%低氧運動組、11.3%低氧運動組大鼠腓腸肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著性升高，說明在一定范圍內(nèi)，氧濃度越低，自噬激活的效果越明顯。此外，就整體而言，11.3%低氧組激活自噬效果最明顯，尤以11.3%低氧耐力運動組效果顯著。

3.2 低氧或結(jié)合耐力運動對肥胖大鼠腓腸肌細胞Sestrin2、AMPKa2蛋白表達的影響

Sestrin 蛋白包含三個不同的亞基，并根據(jù)特定蛋白編碼的基因分SESN1，SESN2 和SESN3，并且這三種亞基包含近50%的相同氨基酸序列[9，11]。作為應激誘導型代謝調(diào)節(jié)器，Sestrins 通過多種機制幫助細胞適應各種應激刺激，包括分解代謝反應的激活、合成代謝活動的停止以及啟動細胞修復機制以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[9]。Sestrins（SESN）是具有多效生物功能的高度保守的蛋白質(zhì)，并且在應激條件下上調(diào)，如DNA 損傷、缺氧、饑餓、生長因子耗盡、輻射和氧化應激等[10，11]。誘導后，Sestrins 保護細胞對抗基因毒性和氧化應激，因此被命名為應激誘導型代謝調(diào)節(jié)劑[9]。Sestrin 基因的失活會導致各種細胞和代謝疾病，如氧化損傷，線粒體功能障礙，脂肪堆積，肌肉退化，加速糖尿病并發(fā)癥進展[12-14]。已知Sestrin2（SESN2）是一種高度保守的應激誘導型代謝蛋白，可抑制活性氧（ROS），并為各種有害刺激（遺傳毒性和氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和缺氧等）提供細胞保護。Lee等[15]研究發(fā)現(xiàn)，敲除Sestrin2/3基因的小鼠在正常的飲食條件下可出現(xiàn)胰島素抵抗癥狀，這提示Sestrins 在機體代謝調(diào)控中可能發(fā)揮著重要作用。此外，當采用si RNAs 抑制細胞SESN2 的基因表達后發(fā)現(xiàn)細胞自噬活性出現(xiàn)顯著性降低[16]，這提示應激狀態(tài)下細胞自噬活性的增強可能是Sestrins 發(fā)揮細胞保護作用的重要機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，8 周的有氧運動可上調(diào)Sestrin2 和Sestrin3 的表達水平，并且單次急性運動可使AMPKα2 與Sestrin2 和Sestrin3 之 間 結(jié) 合 顯著 增加[17]。本研究結(jié)果表明，運動、低氧均能上調(diào)Sestrin2蛋白的表達水平，經(jīng)過8周低氧或結(jié)合耐力運動，運動組、低氧組、運動結(jié)合低氧組肥胖大鼠腓腸肌Sestrin2蛋白都有不同程度的提高，尤以11.3%低氧運動組大鼠腓腸肌的Sestrin2蛋白表達上調(diào)尤為顯著，這可能與缺氧狀態(tài)下HIF-1ɑ 和NO 的活性有關，但其具體機制仍需進一步研究。

Sestrin2 還通過激活關鍵能量感受器AMP 依賴性蛋白激酶（AMPK）和抑制哺乳動物雷帕霉素復合物1（mTORC1），在代謝調(diào)節(jié)中起關鍵作用。AMPK是一種在能量缺乏條件下激活的酶，可作為細胞中mTOR 的主要負調(diào)節(jié)因子。研究表明，Sestrin2 主要通過激活AMPK 和結(jié)節(jié)性硬化癥2（TSC2）的磷酸化來抑制細胞中mTOR的活化[12，18]。在小鼠中，Sestrin2的基因切除增強了mTOR的激活，加重了肥胖相關特征，如葡萄糖耐受不良，胰島素抵抗和肝臟脂肪變性等[12]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過8周的低氧耐力運動，低氧或結(jié)合耐力運動均能夠上調(diào)AMPKα2蛋白的表達水平，并且，在三種低氧濃度的干預下，11.3%低氧結(jié)合耐力運動的效果更為顯著。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運動組大鼠腓腸肌AMPKα 2蛋白表達水平要高于安靜組大鼠，低氧結(jié)合耐力運動組大鼠腓腸肌AMPKα2蛋白表達水平要高于單純低氧組。有研究發(fā)現(xiàn)，短暫低氧暴露（氧濃度為0.2%O2）即可增加心肌細胞AMPK 活性，且呈持續(xù)增加狀態(tài)[19]。與此相似，Liu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)慢性低氧暴露可增強機體大腦AMPK 的表達，進而抑制mTOR 信號通路，從而增強低氧暴露所引起的細胞自噬。本實驗結(jié)果與吳菊花[21]的研究結(jié)果一致，由此可推測，低氧或結(jié)合耐力運動可正向激活AMPK 蛋白的水平。研究結(jié)果顯示，氧濃度與運動的疊加效應要優(yōu)先于單純性低氧和單純性運動，亦可推測，在一定范圍內(nèi)，氧濃度越低，對自噬因子AMPK的影響越顯著。牛燕媚等[22]研究發(fā)現(xiàn)，長期進行有氧運動的小鼠，其骨骼肌中Sestrin2/3的表達水平會有顯著性增加，并且其與AMPK 的結(jié)合也會顯著增加。本研究結(jié)果與之相似，實驗發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠腓腸肌的AMPKα2 能夠被運動和低氧誘導，并且其表達水平在11.3%低氧運動組尤為顯著，Sestrin2蛋白表達趨勢與AMPKα2 基本一致。由此，我們可以推測，Sestrins可能參與AMPK 的激活，參與長期低氧或結(jié)合有氧運動對骨骼肌自噬活性的激活，并在調(diào)節(jié)糖、脂代謝方面起到關鍵作用。雖然在哺乳動物中Sestrins 能夠激活AMPK 已得到證實[23]，但是Sestrins 是直接激活還是與其他因子結(jié)合之后再發(fā)揮作用，其具體機制仍不清楚。Maiuri等研究發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)限制或者Rapamycin干預條件下，shRNA介導的Sestrin2表達抑制顯著降低了自噬活性水平[24]，綜合劉效磊[17]和本實驗的研究結(jié)果，可以推測Sestrins 能夠正向調(diào)控AMPK 的表達，并在其上游發(fā)揮重要作用。

3.3 低氧或結(jié)合耐力運動對肥胖大鼠腓腸肌細胞Beclin1蛋白表達的影響

研究表明，低氧應激后細胞內(nèi)ROS水平升高，激活了核因子κB（NF-κB）信號通路，使Beclin1 活性增高，可見Beclin1活性表現(xiàn)與低氧應激密切相關[25，27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周的低氧或結(jié)合耐力運動，與常氧安靜組相比，其余各組肥胖大鼠腓腸肌Beclin1蛋白的表達都有上升的趨勢。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與常氧安靜組相比，常氧運動組大鼠腓腸肌Beclin1蛋白表達有顯著性升高；與單純性低氧暴露組相比，各低氧結(jié)合耐力運動組大鼠腓腸肌Beclin1 蛋白表達有顯著性升高，11.3%低氧組Beclin1蛋白表達高于常氧組、16.3%低氧組及13.3%低氧組。由此，我們可以看出，單純性耐力運動、低氧暴露、低氧結(jié)合耐力運動均能提高肥胖大鼠腓腸肌Beclin1蛋白表達水平。同樣，Zhang等[26]報道慢性低氧可上調(diào)Bnip3和Beclin1蛋白的表達。由此可以說明，低氧與耐力運動兩種刺激均可以提高肥胖大鼠骨骼肌Beclin1的表達水平，使骨骼肌細胞自噬活性增強，從而有利于維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂。此外，低氧結(jié)合耐力運動組Beclin1表達水平明顯高于單純性耐力運動組和單純性低氧暴露組，證明低氧和運動對大鼠骨骼肌自噬基因表達的誘導具有累積效應。

綜上，低氧或結(jié)合耐力運動可激活細胞自噬，并誘導肥胖大鼠骨骼肌自噬相關蛋白表達增加，且低氧結(jié)合耐力的誘導效果要優(yōu)于單純性運動及低氧暴露。但自噬作為一種細胞保護機制，其活性過高或過低均不利于胞漿中蛋白質(zhì)和細胞器生理功能的發(fā)揮，所以運動負荷、運動方式以及時間對自噬的調(diào)控還需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過對營養(yǎng)性肥胖大鼠進行低氧耐力訓練發(fā)現(xiàn)，運動和低氧都能顯著激活骨骼肌細胞自噬，上調(diào)骨骼肌自噬相關蛋白LC3、Beclin1、AMPKα2、Sestrin2蛋白的表達水平。且與單純運動和單純低氧相比，低氧耐力訓練對自噬的調(diào)控作用更加顯著?？v觀對自噬的研究，有關運動與自噬的研究尚處于起始階段，低氧結(jié)合運動與自噬的研究更是在探索時期，因此，在之后的實驗研究中，還需進一步探討運動、低氧激發(fā)自噬的機制以及自噬適應性變化的原因。