順鉑誘導(dǎo)的急性腎臟損傷中KIM-1的作用研究

吳敬瑩

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部 安徽 合肥 230601）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），原名急性腎衰竭，是臨床常見危重病之一，其以腎功能在短時(shí)間內(nèi)突然迅速下降為主要特點(diǎn)，并同時(shí)伴有一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，臨床發(fā)病率逐年遞增[1]，為目前住院患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。近年來大量的流行病學(xué)和臨床研究表明腎臟損傷因子-1（Kidney Injury Molecule-1，KIM-1）在腎臟損傷不同程度時(shí)會(huì)發(fā)生顯著變化，在腎臟疾病演變?nèi)^程中有著重要的意義，KIM-1系腎臟近曲小管上皮細(xì)胞一種跨膜糖蛋白，于正常腎組織表達(dá)量極低[2]。國(guó)外學(xué)者Kumar研究提示，在腎缺血、腎毒性等誘因所致的急性腎損傷患者中檢測(cè)到KIM-1表達(dá)水平顯著升高，探究原因其細(xì)胞外域經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶作用分解為可溶性片段并釋放到細(xì)胞外，隨后排入尿液中[3]。AKI在臨床早期通常為可逆性損害，如能早期診斷，同時(shí)積極針對(duì)原發(fā)病治療，消除誘因可有效避免其進(jìn)展為實(shí)質(zhì)性腎衰竭，但鑒于此類疾病初期臨床癥狀及體征缺乏特征性，在臨床實(shí)際診療過程中極易出現(xiàn)誤診或漏診，導(dǎo)致部分患者錯(cuò)失臨床治療的最佳時(shí)機(jī)[4]，故尋找有效的控制因子對(duì)于腎臟疾病尤其控制早期腎臟損傷具有重要的意義。

順鉑（Cis-diamine dichloropl atinum，CDDP）是臨床最常用治療實(shí)體性腫瘤療效確切的藥物之一，其臨床療效多與臨床用藥劑量成相關(guān)，但其藥物毒性尤其腎毒性也與劑量正相關(guān)。CDDP的生物活性取決于人體內(nèi)環(huán)境中氯離子濃度，在氯離子濃度較高的血液及細(xì)胞外，CDDP相對(duì)穩(wěn)定，一旦其進(jìn)入氯離子濃度很低的細(xì)胞液中后，CDDP中的兩個(gè)氯離子會(huì)被水所取代，形成水合物。而形成的這種水合物極易與DNA發(fā)生加成反應(yīng)，形成交聯(lián)，破壞DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增殖周期停滯，致使細(xì)胞凋亡。探究CDDP誘發(fā)腎毒性原因，發(fā)現(xiàn)其主要原因是由氧化應(yīng)激引起的氧化性損傷，損傷機(jī)制主要有二：一為大量氧自由基的生成，二則是自由基清除劑減少、受抑。本文就CDDP誘導(dǎo)的鼠急性腎損傷中KIM-1的作用進(jìn)行研究和探討，旨在為腎臟損傷早期尋找有效的控制因子。

1.資料與方法

1.1 一般資料

自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買健康清潔級(jí)雄性C57小鼠20只，體質(zhì)量17～20g，動(dòng)物使用許可證號(hào)（SYXK（皖）2017-006）。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只；正常喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 實(shí)驗(yàn)組小鼠按10mg/kg腹腔注射CDDP，以造成小鼠急性腎損傷模型。對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

1.2.2 樣本采集 用戊巴比妥鈉麻醉小鼠（10%，麻醉后處死），取各組小鼠腎臟組織。-80°冰箱保存，對(duì)小鼠腎臟組織進(jìn)行剝離，中間段進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，兩邊進(jìn)行提取組織蛋白進(jìn)而對(duì)相應(yīng)蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取每組10只小鼠腎臟組織固定24h后，按常規(guī)制作蠟塊、切片，進(jìn)行KIM-1免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.4 Westernblot檢測(cè) 稱量組織1000mg腎臟組織，加入10μl蛋白裂解液（1ml RIPA:10μl PMSF），于冰上裂解30min，不間斷晃動(dòng)培養(yǎng)瓶或六孔板；再將裂解液、細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)至預(yù)冷的1.5mlEP管中，渦旋數(shù)次至裂解充分；經(jīng)過4℃，12000rpm，30min離心后；移入上清液至新的1.5mlEP管中（記錄上清液體積）；蛋白定量；加入5×蛋白上樣緩沖液，4個(gè)體積的蛋白溶液加一個(gè)體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻，分裝于0.5ml EP管中；100℃，10min，使蛋白充分變性；提取符合濃度純度要求的蛋白，置-20℃保存。

Westernblot顯影結(jié)果采用Image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析光密度，量化蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 模型結(jié)果

2.1.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 腎臟病理結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟KIM-1陽(yáng)性表達(dá)顯著增高，對(duì)照組小鼠腎臟損傷因子棕黃色陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)于模型組顯著減少（圖1）。

圖1 兩組腎臟組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果圖

2.2 Westernblot結(jié)果

兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2 Westernblot結(jié)果

3.討論

本實(shí)驗(yàn)研究旨在建立順鉑（Cis-diamine dichloro platinum，CDDP）誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠模型，檢測(cè)KIM-1在此模型中小鼠腎臟表達(dá)的不同。目前CDDP導(dǎo)致急性腎毒性的機(jī)制未完全明了，部分學(xué)者研究提示CDDP攝入機(jī)體內(nèi)后能在腎組織濃聚，排泄途徑主要為經(jīng)腎排泄，而這種腎組織濃集的特征性組織分布、以及主要由腎排泄特性，可能是其腎毒性的原因所在[5]。實(shí)驗(yàn)通過CDDP的腎毒性誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的壞死、細(xì)胞凋亡、炎癥介質(zhì)損傷等機(jī)制產(chǎn)生急性腎損傷。目前研究表明KIM-1作為一種新Ⅰ型跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、黏蛋白結(jié)構(gòu)域、特征性Ig結(jié)構(gòu)域等，通常KIM-1在正常肝、腎及脾組織呈微量或低量表達(dá)，但在急性腎損傷后再生的近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)量顯著提高，提示與急性腎損傷嚴(yán)重程度相關(guān)性強(qiáng)，表明其在腎小管上皮細(xì)胞早期損傷及修復(fù)、腎間質(zhì)纖維化修復(fù)中均具有重要作用，同時(shí)具有信號(hào)傳導(dǎo)、黏附及參與免疫反應(yīng)等功能。研究提示KIM-1細(xì)胞外域經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶作用分解為可溶性片段，并釋放到細(xì)胞外，隨后排入尿液中，故可于尿液中檢測(cè)出KIM-1可溶性片段。學(xué)者趙進(jìn)等研究提示，在臨床腎缺血導(dǎo)致急性腎小管壞死患者尿液中，KIM-1表達(dá)水平顯著升高，KIM-1尿液中測(cè)定值為其他急性腎損傷因素導(dǎo)致的急性腎小管壞死患者數(shù)值約4倍，其次誘因是臨床造影使用的對(duì)比劑所致的急性腎小管壞死[6]。

筆者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，在實(shí)驗(yàn)組中病理學(xué)水平和蛋白水平均呈現(xiàn)出KIM-1的高表達(dá)，無(wú)論腎毒性還是腎缺血所致腎損傷，尿KIM-1作為評(píng)估腎損傷的標(biāo)志物優(yōu)于BUNSCR及尿NAGL這些傳統(tǒng)的指標(biāo)。因此提示KIM-1是種可靠的早期檢測(cè)腎損傷的生物學(xué)標(biāo)志物。