黃藤染色體核型及基因組大小分析

史晶晶, 徐瑞晶, 徐浩, 馬霜, 賈秋蕊, 高志民*

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黃藤染色體核型及基因組大小分析

史晶晶1,2, 徐瑞晶1,3, 徐浩1,2, 馬霜1,2, 賈秋蕊4, 高志民1,2*

(1. 國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100102; 2. 國(guó)際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)研究所, 北京 100102; 3. 國(guó)際竹藤中心熱帶森林植物研究所, 海南 三亞 572000; 4. 河北省唐山市遷西縣林業(yè)局, 河北 唐山 064300)

為探究黃藤()染色體核型和基因組的大小，采用體細(xì)胞染色體常規(guī)制片法與顯微攝影技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)黃藤染色體進(jìn)行了核型分析，同時(shí)以番茄()為內(nèi)標(biāo)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)黃藤葉片基因組大小、DNA含量和DNA倍性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，黃藤莖尖是理想的染色體制片材料；黃藤的染色體數(shù)為2=24, 核型公式為K(2)=1M+17m+5sm+1st，核型類(lèi)型為2C；核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)61.20%；黃藤的DNA含量為1.57 pg，基因組大小為1 539.53 Mb，黃藤的DNA倍性為二倍體(2)。這是首次報(bào)道黃藤的核型和基因組大小，為深入開(kāi)展黃藤屬及其近緣屬植物的核型和基因組比較分析提供了參考依據(jù)。

黃藤；染色體；核型；基因組

染色體是在細(xì)胞周期的分裂中期形成的高度縊縮的結(jié)構(gòu)，是遺傳信息的載體。每種植物的體細(xì)胞都具有一定的染色體，其臂長(zhǎng)、臂比、染色體長(zhǎng)度比、著絲粒位置等特征各具特點(diǎn)，是區(qū)分不同物種的便捷形象表征，單個(gè)細(xì)胞中染色體數(shù)量與結(jié)構(gòu)特征即核型[1]。植物體細(xì)胞的核型分析是一種通過(guò)觀察染色體的數(shù)目、大小以及形態(tài)來(lái)分析染色體類(lèi)型的技術(shù)方法。在核型分析中，主要是以染色體全長(zhǎng)、著絲粒位置、臂長(zhǎng)和隨體等為依據(jù)[2]。核型分析技術(shù)為生物基因組學(xué)提供了系統(tǒng)直觀的基礎(chǔ)資料，對(duì)研究物種的遺傳、變異、起源以及進(jìn)化具有重要意義，對(duì)于植物系統(tǒng)分類(lèi)和品種改良的育種實(shí)踐具有重要意義。流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)[3]，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)[4]、細(xì)胞生物學(xué)[5]、微生物學(xué)[6]、遺傳學(xué)等領(lǐng)域，也被廣泛應(yīng)用于基因組大小的測(cè)定。研究物種的基因組大小可為基因組分析提供重要的參考依據(jù)。

棕櫚藤為棕櫚科(Palmae)省藤亞科(Calamoideae)省藤族(Calameae)植物，是熱帶森林的重要植物類(lèi)群，全世界共有13屬，約600種，主要分布在亞洲、非洲、大洋洲等熱帶地區(qū)[7]。在我國(guó)，棕櫚藤主要集中分布在熱帶、南亞熱帶地區(qū)，約有3屬40種21變種[8]。棕櫚藤藤莖的強(qiáng)度、韌性、彈性以及易于造型等優(yōu)良工藝特性，使其成為編制工業(yè)的優(yōu)良材料，原藤是僅次于木材和竹材的重要林產(chǎn)品[9], 其開(kāi)發(fā)利用已成為林業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。目前，我國(guó)的棕櫚藤工業(yè)以傳統(tǒng)編織為主，技術(shù)水平較高，但我國(guó)的藤資源短缺，大部分依靠進(jìn)口。由于原藤進(jìn)口價(jià)格的昂貴，如何更好的培育原藤資源，合理開(kāi)發(fā)利用棕櫚藤資源成為我國(guó)棕櫚藤業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題。為更好地開(kāi)發(fā)利用棕櫚藤資源，實(shí)現(xiàn)遺傳改良，首先要了解其細(xì)胞學(xué)和遺傳信息，然而對(duì)棕櫚藤細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)的研究報(bào)道卻寥寥無(wú)幾。報(bào)道主要集中于省藤屬()植物[10–13], 如小省藤(.)、盈江省藤(.var.)、寬刺藤(.)、高地省藤(.var.)。省藤屬植物體細(xì)胞染色體數(shù)均為2=26[10]，澤生藤(.)的體細(xì)胞染色體數(shù)為2=28[11]。黃藤()為棕櫚科鱗果亞科(Lepidocaryoideae)省藤族(Calameae)黃藤屬植物，是我國(guó)棕櫚科單屬單種植物[14]，藤莖質(zhì)地柔韌，抗拉強(qiáng)度高，具有良好的工藝特性，適于編制和家具制作；藤筍富含維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，是良好的蔬菜；藤種質(zhì)地堅(jiān)硬，可用于制作“佛珠”[15]；黃藤果實(shí)具有較高的藥用價(jià)值，可用于提取血竭，血竭具有活血化瘀、收斂止血、消腫止痛、補(bǔ)血益氣等功效[16]。因此，黃藤是具較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景的多用途珍貴森林植物[17]。然而，黃藤的核型和基因組大小尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)黃藤進(jìn)行核型分析以及基因組大小的測(cè)定，將為研究黃藤的遺傳變異和起源進(jìn)化提供參考依據(jù)，對(duì)于黃藤的基因組分析、種質(zhì)資源利用以及品種改良的育種實(shí)踐具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

從海南三亞甘什嶺天然林林下(109°40′18.76″ E，18°23′06.56″ N，海拔261 m)挖取黃藤()實(shí)生苗(1年生)帶回實(shí)驗(yàn)室, 在人工氣候室內(nèi)盆栽培養(yǎng)(26℃，光照強(qiáng)度200mol m–2s–1, 光/暗=16 h/8 h)。選擇生長(zhǎng)狀況良好的藤苗，取根尖和莖尖為核型分析的試驗(yàn)材料，同時(shí)取葉片用于基因組大小分析，以番茄()葉片作為參比。

1.2 藥品、耗材和儀器

藥品和耗材：2 mmol L–18-羥基喹啉、FAA固定液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1體積比)、1 mol L–1HCl、改良苯酚品紅溶液、碘化丙啶(PI)染色液、WPB裂解液、纖維素酶、果膠酶、載玻片、蓋玻片、鑷子、刀片、解剖針、濾紙、300目濾網(wǎng)、培養(yǎng)皿等。

儀器：Zeiss Axio Scope A1熒光顯微鏡以及配套的ProgRes CapturePro成像系統(tǒng)、Adobe Photoshop cc 2017圖片處理軟件、ImageJ測(cè)量軟件、VIDEO- TEST-KYRYO 3.1核型分析軟件、BD?FACSCalibur流式細(xì)胞儀、離心機(jī)等。

1.3 染色體制片

取黃藤的根尖或莖尖(長(zhǎng)約0.5 cm)，用蒸餾水沖洗干凈，用2 mmol L–18-羥基喹啉預(yù)處理1 h; 將預(yù)處理后的黃藤根尖或莖尖用卡諾固定液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=1∶3,/)在4℃冰箱中固定5~24 h; 用1 mol L–1HCl在60℃水浴鍋中解離15 min，之后加入2%纖維素酶和1%果膠酶的混合酶液，在37℃水浴鍋中解離2 h；用改良苯酚品紅溶液染色10~15 min并進(jìn)行壓片；使用Zeiss Axio Scope A1熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢，挑選染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.4 染色體核型分析

將具有完整細(xì)胞輪廓，且染色體分散良好的細(xì)胞用ProgRes CapturePro軟件進(jìn)行圖像采集。根據(jù)一般統(tǒng)計(jì)要求，選擇30個(gè)染色體分散良好的有絲分裂中期細(xì)胞進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)具有一致染色體數(shù)目的細(xì)胞，把85%以上細(xì)胞都具有的染色體數(shù)目定為該植物的染色體數(shù)目。另外，選取5個(gè)染色體形態(tài)清晰且無(wú)重疊的細(xì)胞，使用Adobe Photoshop cc 2017進(jìn)行圖片修整，利用VIDEOTEST- KYRYO 3.1核型分析軟件對(duì)染色體進(jìn)行分析，將染色體以著絲粒位置為基準(zhǔn)拉直，并進(jìn)行同源染色體匹配。將分析后的染色體核型圖片放到ImageJ測(cè)量軟件中對(duì)染色體的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。參照李懋學(xué)等[18]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析，用Leven[19]的公式進(jìn)行染色體的相對(duì)長(zhǎng)度的計(jì)算；按郭幸榮等[20]提出的染色體長(zhǎng)度分類(lèi)方法，對(duì)黃藤細(xì)胞染色體的相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)(染色體長(zhǎng)度/全組染色體平均長(zhǎng)度)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分類(lèi)；核型類(lèi)型參照Stebbins[21]的標(biāo)準(zhǔn)，按核型中染色體長(zhǎng)度比(最長(zhǎng)染色體與最短染色體之比)以及臂比(r=長(zhǎng)臂/短臂)大于2的染色體所占比例進(jìn)行劃分；采用Arano[22]的方法計(jì)算核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)(As.K=長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)×100%)。

1.5 流式細(xì)胞儀樣品制備和分析

取黃藤實(shí)生苗葉片(約1.5 cm)洗凈，放入培養(yǎng)皿中，加入800L裂解液浸泡30 min；用刀片將葉片切碎后補(bǔ)加800L裂解液，輕輕搖勻混合；用300目濾網(wǎng)過(guò)濾到10 mL玻璃管中，于4℃下129×離心8 min；棄上清后加入300L的碘化丙啶(PI)染液在4℃下染色20 min；使用流式細(xì)胞儀(Beck- man Coulter, Inc., Cell Lab Quanta SC)進(jìn)行測(cè)量，樣品變異系數(shù)控制在5%以?xún)?nèi)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

已知番茄2C DNA含量為0.92 pg[23](1 pg=978 Mb), 并根據(jù)公式[24]計(jì)算黃藤的2C DNA含量= [(樣品G1平均峰值)/(番茄G1平均峰值)]×番茄2C DNA含量(pg)。

2 結(jié)果和分析

2.1 染色體數(shù)目

將黃藤莖尖和根尖的染色體制片在顯微鏡下鏡檢，由莖尖細(xì)胞制片可觀測(cè)到大量的細(xì)胞，且容易找到處于有絲分裂中期、染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行圖像采集，而根尖制片效果較差。因此，以黃藤莖尖制片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測(cè)量。根據(jù)核型分析標(biāo)準(zhǔn)化建議擇優(yōu)挑選出30個(gè)具有完整中期分裂相的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，有26個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)目為24，因此黃藤的染色體數(shù)目為2=24 (圖1)。

2.2 染色體核型分析

選擇5個(gè)染色體形態(tài)清晰無(wú)重疊的細(xì)胞，進(jìn)行染色體核型參數(shù)的測(cè)量計(jì)算。結(jié)果表明，染色體的相對(duì)長(zhǎng)度為1.554%~7.683%，其中短臂相對(duì)長(zhǎng)度為0.586%~3.143%，長(zhǎng)臂相對(duì)長(zhǎng)度為0.968%~4.540%; 相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)為0.373 03~1.843 89 (表1)。根據(jù)染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)對(duì)染色體進(jìn)行分類(lèi)，黃藤的長(zhǎng)染色體(L)有2條，中長(zhǎng)染色體(M2)有9條，中短染色體(M1)有10條，短染色體(S)有3條；黃藤染色體的長(zhǎng)度比是1.55%；臂比為1~3.217，黃藤染色體的著絲粒位置為m型的有17條，st型的有1條，sm型的有5條，M型的有1條。黃藤染色體中有20.83%的臂比大于2，最長(zhǎng)與最短染色體比值為4.94。因此, 黃藤的核型為“2C”型，其核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為61.20%。

圖1 黃藤染色體圖。A: 中期染色體; B: 核型。

表1 黃藤染色體核型

使用Excel軟件根據(jù)染色體相對(duì)長(zhǎng)度[25]作圖,得到黃藤染色體核型模式圖(圖2)。

2.3 DNA含量分析

以番茄為內(nèi)標(biāo)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析黃藤的DNA相對(duì)含量。結(jié)果表明，碘化丙啶(PI)著色后檢測(cè)到的G1期細(xì)胞的熒光分布呈高斯曲線分布，其中紅色為對(duì)照番茄的峰值出現(xiàn)在約41.01位置, 黃藤的則出現(xiàn)在約68.67的位置；G2期擁有2倍G1期細(xì)胞的DNA含量，呈現(xiàn)2倍于G1信號(hào)的高斯峰(Dip G2, An1 G2) (圖3)。

根據(jù)已知番茄的DNA含量，估算出黃藤的DNA含量為1.57 pg，黃藤為二倍體植物(2= 24)，按照1 pg=978 Mb，黃藤的基因組大小約為1 539.53 Mb。

3 討論

細(xì)胞染色體制片受很多因素的影響，合適的試驗(yàn)取材是非常重要的一個(gè)因素。一般認(rèn)為植物莖尖細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，葉綠素含量較多，不適宜用于觀察染色體，因此多選用植物的根尖分生區(qū)進(jìn)行染色體觀察。腰希申等[26]的研究表明，黃藤莖尖可長(zhǎng)期保持分生能力，因此本試驗(yàn)同時(shí)選擇黃藤的根尖和莖尖作為試驗(yàn)材料進(jìn)行核型分析。解離可去除細(xì)胞間的果膠層，使細(xì)胞壁軟化，便于壓片[27]，本試驗(yàn)對(duì)莖尖和根尖采用酸解法、酶解法和先酸解后酶解法等分別處理后進(jìn)行鏡檢比較，結(jié)果表明使用先酸解后酶解的解離方法對(duì)黃藤莖尖的效果最好，能夠得到更多良好的染色體圖像，同時(shí)莖尖的制片效果優(yōu)于根尖。這可能是因?yàn)辄S藤莖尖是包被在多層葉片內(nèi)部，比較幼嫩且葉綠素含量較低，而黃藤實(shí)生苗的根數(shù)量較少，且主根分支較少，根尖相對(duì)老化所致。

圖2 黃藤染色體核型模式圖

圖3 以番茄為內(nèi)標(biāo)測(cè)定黃藤的流式細(xì)胞圖。番茄: Dip G1、Dip G2和Dip S; 黃藤: An1 G1、An1 G2和An1 S; ▲: G1期的峰值。

染色體是細(xì)胞核中遺傳物質(zhì)的載體，通常是在細(xì)胞周期的分裂中期形成的高度集縮的結(jié)構(gòu)，染色體是不同物種基因組最簡(jiǎn)單明了的形象表現(xiàn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃藤具有24條染色體，核型為“2C”型，核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為61.02%，核型公式為K(2)= 1M+17m+5sm+1st。這是首次對(duì)黃藤進(jìn)行核型分析，為黃藤屬植物的起源進(jìn)化研究以及物種分類(lèi)提供了理論依據(jù)。

基因組大小是指1個(gè)基因組中所擁有的DNA的含量，是一個(gè)物種所特有的遺傳學(xué)參數(shù)，其與物種分類(lèi)和進(jìn)化位置具有一定關(guān)系，一般認(rèn)為植物進(jìn)化程度越高，其基因組越大[28]。隨著流式細(xì)胞術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)在基因組大小測(cè)定方面有著非常廣泛的應(yīng)用[29]。本試驗(yàn)參考田新民等[30]的方法選擇番茄為參照，在流式細(xì)胞樣品的制備過(guò)程中，選擇木本植物緩沖液WPB解離液[31]提取黃藤細(xì)胞核，選擇具有較高的分辨率及較低的毒性的PI染料[24]進(jìn)行染色，結(jié)果黃藤的基因組大小為1.57 pg。有報(bào)道黃藤屬.的基因組大小4C DNA為11.10 pg[32]，這可能與采用的方法和物種倍性不同有關(guān)。

隨著物種的不斷繁衍進(jìn)化，雜交、多倍體及無(wú)融合生殖，使原本可以識(shí)別的類(lèi)群之間的界限變的模糊不清，形成多倍體復(fù)合體，給分類(lèi)學(xué)處理帶來(lái)了極大的困難[33]，分子水平與細(xì)胞水平研究的結(jié)合是生命科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)所向。染色體核型分析作為一項(xiàng)融合細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、染色體工程學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)植物進(jìn)行核型分析、構(gòu)建染色體圖譜、植物親緣關(guān)系鑒定以及起源進(jìn)化研究具有重要意義，可以為植物系統(tǒng)分類(lèi)提供重要依據(jù)。棕櫚藤是熱帶森林中的多用途植物資源，黃藤是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景的藤種之一，本研究測(cè)定黃藤為二倍體，基因組大小約為1 539.53 Mb。黃藤的倍性與基因組大小對(duì)于更為深入地開(kāi)展細(xì)胞生物以及分子生物研究將具有極大的促進(jìn)作用，同時(shí)也為開(kāi)展其它棕櫚藤的研究提供了一定的參考依據(jù)。

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Karyotype and Genome Size Analyses of

SHI Jing-jing1,2, XU Rui-jing1,3, XU Hao1,2, MA Shuang1,2, JIA Qiu-rui4, GAO Zhi-min1,2*

(1. State Forestry Administration Key Open Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Rattan,Beijing 100102, China; 2. Institute of Gene Science for Bamboo and Rattan Resources, International Center for Bamboo and Rattan (ICBR), Beijing 100102, China; 3. Institute of Tropical Forest Plant, ICBR, Sanya 572000, Hainan, China; 4. Qianxi County Forestry Bureau, Tangshan 064300, Hebei, China)

In order to explore the karyotype and genome size of, the root and stem tips from its seedlings were used as experimental materials. The karyotype of., including chromosome number and morphology were analyzed by combining the conventional method of somatic cell chromosome preparation with microphotography. Meanwhile, the DNA content, genome size and ploidy of leaves were determined by flow cytometry usingas an internal reference. The results showed that the stem tip of.was an ideal material for chromosome preparation, and the chromosome number was 2=24, along with the formula of karyotype was K(2)=1M+17m+5sm+1st, and the karyotype was “2C”. The karyotype asymmetry index of.was 61.20%. The DNA content of.was about 1.57 pg with the genome size of 1 535.53 Mb, and the DNA ploidy was diploid (2). This was reported the karyotype and genome size of.for the first time, which provided a reference for studying the karyotype and genome of other species inand related genus.

; Chromosome; Karyotype; Genome

10.11926/jtsb.3982

2018-08-13

2018-09-25

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD04B0101)資助

This work was supported by the Planning Project for National Science and Technology of Rural Areas in the 12th Five-year (Grant No. 2015BAD04B0101).

史晶晶，女，碩士研究生。E-mail: shijingjing@icbr.ac.cn

通信作者 Corresponding author.E-mail: gaozhimin@icbr.ac.cn