膿毒癥患兒外周血CD4+T細胞Bip、ATF6及DDIT3表達水平變化

商躍云，張 慧，林書祥，舒劍波

1.天津市兒童醫(yī)院急診內(nèi)科(天津300134)；2.天津市兒科研究所分子生物學實驗室(天津300134)

膿毒癥是由感染、創(chuàng)傷等因素引起的全身炎癥反應綜合征，是臨床常見的急危重癥，可導致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，具有發(fā)病兇猛、進展迅速、預后差的特點。目前，膿毒癥引起MODS的機制并不十分明確，因其難治性及高病死率一直是急危重癥的重點和難點[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)是機體對外來刺激的應激性反應，當機體功能紊亂時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白聚集誘發(fā)ERS，導致細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)ERS在炎性反應及氧化應激中起重要作用[2]。正常狀態(tài)情況下激活轉錄因子6(Activating transcription factor 6, ATF6)與免疫球蛋白結合蛋白(Immunoglobulin binding protein，Bip)結合成復合物而不存在生物學活性，在ERS時與其解離，到達高爾基體被剪切后具有轉錄激活物的活性，進入細胞核內(nèi)上調(diào)與蛋白質(zhì)折疊相關的各類結合蛋白和酶的表達，應對不良微環(huán)境，在持續(xù)不良環(huán)境影響下通過上調(diào)特異性促凋亡因子DNA損傷誘導轉錄蛋白3(DNA-damage-inducible transcript 3 protein, DDIT3)介導細胞凋亡[3]。本研究以實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real time polymerase chain reaction，Real-time PCR)法檢測膿毒癥患兒外周血CD4+T淋巴細胞Bip、ATF6及DDIT3 mRNA表達水平變化，初步探討CD4+T淋巴細胞ERS ATF6通路在膿毒癥多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的發(fā)生發(fā)展中的作用，為其治療提供依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 本研究屬觀察性研究，收集2018年1月至2018年12月于天津市兒童醫(yī)院確診的膿毒癥兒童，根據(jù)出院結局分為存活組和死亡組，每組隨機選取30例，納入標準：均符合膿毒癥診斷標準[4]，且經(jīng)過血、尿、痰標本培養(yǎng)及X線胸片、超聲、CT檢查確定感染部位。同時選取天津市兒童醫(yī)院同期體檢的健康兒童30例作為對照組。排除標準：既往患有自身免疫性疾病、正在應用免疫抑制劑、AIDS和腫瘤患者。對照組30例，男15例，女15例，年齡(6.27±3.50)月；存活組30例，男14例，女16例，年齡(7.37±3.91)月；死亡組30例，男16例，女14例，年齡(7.03±3.76)月；三組性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.27,F=0.69，均P>0.05)，具有可比性。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，且受試者家長均知情同意。

2 研究方法

2.1 診治方法：所有確診患兒均以邁瑞PM-9000便攜式多參數(shù)監(jiān)護儀予生命體征監(jiān)測，以邁瑞(Mindray)全自動五分類血液分析儀 BC-5140行血常規(guī)，以優(yōu)利特(Urit)全自動生化分析儀 8020A行電解質(zhì)、肝腎功能、心肌損傷標志物、C反應蛋白(C reactive protein, CRP)、降鈣素原(Procalcitonin, PCT)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及血乳酸，以貝克曼ACLTOP 300全自動血凝分析儀行D-二聚體，以雅培(ABBOTT)i2000全自動免疫分析儀行腦尿鈉肽(Brain natriuretic peptide, BNP)，以雷度(Radiometer)ABL80血氣分析儀行血氣分析等相關檢查，經(jīng)過血、尿、痰標本培養(yǎng)及X線胸片、超聲、CT檢查確定感染部位。并予心電圖、超聲心動圖監(jiān)測心臟損害。根據(jù)小兒危重病例評分法(草案)進行小兒危重病例評分(Pediatric clinical illness score, PCIS)[5]并根據(jù)2016年膿毒癥與膿毒性休克處理國際指南[4]給予膿毒癥集束化治療，包括液體復蘇、抗生素、糖皮質(zhì)激素等治療。

2.2 外周血CD4+T淋巴細胞Bip、ATF6及DDIT3 mRNA水平的檢測：對照組、存活組及死亡組于確診時抽取外周靜脈血3 ml，存活組于痊愈出院前抽取外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝靜脈血，聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法(批號：P8610)分離外周血單個核細胞。按試劑盒(Invitrogen Technologies Inc，USA，批號：15596-06)說明，采用免疫磁珠分離外周血CD4+T淋巴細胞，錐蟲藍染色判定細胞活力>95%，流式細胞術檢測細胞純度>97%，備用。取已分離外周血單個核細胞，按試劑盒說明書(Tiangen)步驟分離總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量，吸光度260/280比值判定純度，瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測完整性。經(jīng)逆轉錄合成cDNA后(Tiangen)，進行PCR擴增。內(nèi)參照肌動蛋白(β-actin)與目的片段Bip、ATF6及DDIT3的引物應用軟件Gene Runner、并根據(jù)GenBank所發(fā)布的目的基因序列自行設計， 同時經(jīng)NCBI BLAST檢索無顯著同源性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體引物序列和擴增產(chǎn)物片段長度見表1。

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real time polymerase chain reaction，Real-time PCR)法測定mRNA水平，Real-time PCR反應體系參照SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒(Tiangen)說明書。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性5min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸34s，進行40個循環(huán)。溫度變化速度為3℃/s，在每個循環(huán)延伸階段檢測熒光信號，進行實時監(jiān)控，最后進入解鏈階段，繪制產(chǎn)物的融解曲線，以了解樣品擴增的特異性，保證測定結果的準確可靠。數(shù)據(jù)的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成。每管樣品重復測定4次，Real-time PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，用GelDoc凝膠成像分析儀掃描電泳結果，根據(jù)產(chǎn)物分子量大小來進一步鑒定產(chǎn)物特異性。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈反應引物

注：Bip：免疫球蛋白結合蛋白；ATF6：激活轉錄因子6；DDIT3：DNA損傷誘導轉錄蛋白3；β-actin：β-肌動蛋白

結 果

1 膿毒癥存活組與死亡組實驗室檢查相關栺標結果比較 存活組與死亡組CRP、PCT、IL-6、血乳酸、D-二聚體、BNP及PCIS的差異有統(tǒng)計學意義(t=7.77、11.40、21.88、5.11、9.53、4.27、2.80, 均P<0.01)。存活組CRP、PCT、IL-6、血乳酸、D-二聚體及BNP均低于死亡組，PCIS高于死亡組。見表2。

表2 膿毒癥存活組組與死亡組實驗室檢查相關栺標比較(95%可信區(qū)間)

2 對照組、存活組與死亡組ATF6、GRP78及Bip mRNA相對表達水平的比較 對照組、存活組與死亡組Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=586.49、313.55、764.23, 均P<0.01)，存活組Bip、ATF6及DDIT3水平高于對照組[(3.01±0.67)與(1.00±0.32)、(2.17±0.37)與(1.00±0.28)、(4.44±0.64)與(1.00±0.20)]，而低于死亡組[(3.01±0.67)與(6.63±0.84)、(2.17±0.37)與(3.26±0.39)、(4.44±0.64)與(10.02±1.41)]。見表3。

表3 對照組、存活組與死亡組Bip 、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平比較(95%可信區(qū)間)

注：▲P<0.01，★P<0.05

3 存活組確診時與治療后Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平比較 存活組確診時與治療后Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平的差異有統(tǒng)計學意義(t=16.31、19.20、39.10, 均P<0.01)，存活組治療后Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平低于確診時水平。

表4 存活組確診時與治療后Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平比較(95%可信區(qū)間)

討 論

多種病理因素阻礙新合成多肽鏈的折疊成熟，致大量未折疊和錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，導致ERS，包括未折疊蛋白反應、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷反應和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應等[6]，其中未折疊蛋白反應通過ATF6、肌醇需求酶1和雙鏈依賴的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶介導降低未折疊蛋白濃度[7]，刺激過強或過久則會發(fā)生細胞損傷及炎性反應[8]。正常狀態(tài)下，ATF6是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的II型跨膜蛋白，存在兩個結構域：氮末端含有轉錄激活結構域，位于胞質(zhì)內(nèi)，參與多個信號傳導系統(tǒng)；碳末端具有參與響應應激反應的結構域，存在2個高爾基體定位信號結合位點和多個Bip結合位點，參與未折疊蛋白反應、凋亡過程調(diào)控、轉錄調(diào)控、蛋白質(zhì)的折疊及信號轉導等[8]。Bip定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，正常情況下與ATF6碳末端結合使其失活，從而起到負調(diào)控凋亡信號通路和淋巴細胞活化，參與信號轉導[9]。

細胞狀態(tài)正常情況下ATF6與Bip結合成穩(wěn)定的復合物停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，不存在生物學活性，在ERS時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的未折疊蛋白堆積能使ATF6與其解離，以囊泡轉移的方式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉移到高爾基體，通過在高爾基體內(nèi)核內(nèi)切酶剪切后成為游離形態(tài)，具有轉錄激活物的功能，進入細胞核內(nèi)，與結合DNA的ERS反應元件結合，激活未折疊蛋白反應相關的基因轉錄，上調(diào)Bip、GRP78和X-盒結合蛋白1等轉錄因子表達，同時也上調(diào)與蛋白質(zhì)折疊相關的各類結合蛋白和酶的表達，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊、分泌和降解，增強未折疊蛋白反應，以減輕或中止ERS，從而恢復細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[10]。DDIT3也稱為CAAT/增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)，一般情況下主要存在于細胞質(zhì)中，表達量很少，在ERS下，DDIT3的表達會大大增加，過度表達的DDIT3可進一步誘導細胞凋亡，DDIT3介導的細胞凋亡主要是通過與cAMP反應元件結合蛋白形成二聚體，形成的二聚體再進一步抑制抗凋亡Bcl-2的表達，從而耗竭谷胱甘肽，增強線粒體對有關凋亡因子的敏感性，最終導致細胞凋亡。因此Bip和DDIT3表達上調(diào)常被當作ERS細胞凋亡的標志[11]。

膿毒癥是指因感染引起宿主炎癥和免疫反應失調(diào)而導致危及生命的器官功能障礙，膿毒癥常伴有免疫紊亂，主要表現(xiàn)為T淋巴細胞亞群的功能紊亂，促炎介質(zhì)和化學因子釋放，細胞因子風暴造成MODS[12]。近年機體免疫反應及ERS成為膿毒癥研究的熱點，但多限于細胞或動物實驗[13]，人體膿毒癥ERS的相關研究較少，且尚未見膿毒癥CD4+T淋巴細胞ERS存在及所起作用的研究報道。

本研究證實，膿毒癥CD4+T淋巴細胞Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平升高，且死亡組CD4+T淋巴細胞Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平高于存活組，提示膿毒癥CD4+T淋巴細胞存在ERS，ERS由ATF6途徑的活化實現(xiàn)，且ERS ATF6途徑的活化程度與病情的嚴重程度可能相關；本研究還證實，膿毒癥存活組CD4+T淋巴細胞Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相對表達水平升高，隨病情好轉而降低。輕度適當?shù)腅RS可清除未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白，促進內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；感染嚴重，刺激過強則導致未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白不能及時清除，細胞穩(wěn)態(tài)不能及時回復，由DDIT3的激活誘導細胞壞死/凋亡，CD4+T淋巴細胞Bip、ATF6及DDIT3 mRNA表達水平的明顯升高意味著大量CD4+T淋巴細胞發(fā)生壞死/凋亡，CD4+T細胞的凋亡還影響了其在信號傳導中的作用，細胞膜崩解和內(nèi)容物的溢出，散漏的內(nèi)容物有對炎性細胞的趨化性物質(zhì)，導致自身抗體和抗核抗體的產(chǎn)生，核物質(zhì)可作為多克隆B淋巴細胞活化劑和特異的核抗原，核小體可通過電荷引力與血管內(nèi)膜結合，成為炎性反應的靶抗原所在部位，從而參與膿毒癥及MODS的發(fā)生發(fā)展[14]。故而推測抑制ERS，可能減輕細胞凋亡，增加膿毒癥的存活率。

膿毒癥病理生理機制較為復雜，即使通過積極治療仍效果欠佳，與ERS及其介導的細胞壞死/凋亡和不受控制的炎性反應有關。探索ERS在膿毒癥中的具體機制，嘗試對ERS通路進行干預，可能是將來膿毒癥治療的新途徑。