擠壓協(xié)同淀粉酶法制備高粱蛋白及其組成分析

周劍敏 尹方平 于 晨 湯曉智

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

高粱籽粒中富含淀粉與蛋白質(zhì)，其中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%～70%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%～11%。高粱中淀粉比重很高，是我國(guó)白酒釀造工業(yè)中的重要原料[1]。高粱蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅次于淀粉，作為釀酒工業(yè)中的副產(chǎn)物，其開(kāi)發(fā)利用相對(duì)較少。目前報(bào)道的高粱蛋白提取方法主要有有機(jī)溶劑法[2]、還原劑法[3]、超聲波輔助提取法[4]和堿法[5]等。這些方法普遍存在的問(wèn)題是蛋白質(zhì)提取率和蛋白質(zhì)純度較低，其原因主要與高粱蛋白在高粱中的存在形式和結(jié)合結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。DUODO等[6]和SCHOBER等[7]指出高粱醇溶蛋白位于球形的蛋白質(zhì)體內(nèi)，該蛋白質(zhì)體包埋在谷蛋白基質(zhì)內(nèi)，同時(shí)周?chē)h(huán)繞著淀粉顆粒。這種淀粉-蛋白質(zhì)的包埋體系限制了高粱蛋白的提取和利用，也導(dǎo)致了高粱蛋白的消化率低，溶解性差。

已有研究證明，擠壓技術(shù)可以通過(guò)破壞淀粉-蛋白質(zhì)的包埋體系，提升高粱蛋白的消化率和溶解性。FAPOJUWO等[8]報(bào)道指出擠壓處理能夠?qū)⒏吡坏鞍椎捏w外消化率提升至30%。Dahlin等[9]在物料含水量20%，擠壓溫度為177 ℃，喂料速度為345 kg/h的條件下擠壓高粱，結(jié)果表明高粱醇溶蛋白在乙醇溶液中的溶解性顯著提高，蛋白消化率也增加18%。劉明等[10]研究了雙螺桿擠壓機(jī)處理白高粱粉，研究表明在擠壓溫度150 ℃，物料水分17%，喂料速度300 g/min,螺桿轉(zhuǎn)速275 r/min條件下，產(chǎn)品的體外蛋白質(zhì)消化率達(dá)到最大值。在擠壓過(guò)程中，高溫、高壓、高剪切的條件使淀粉糊化和部分降解[11]，同時(shí)打破淀粉-蛋白質(zhì)的緊密包埋結(jié)構(gòu)[12]，因此有可能進(jìn)一步通過(guò)淀粉酶的處理，有效提取高粱蛋白。

本研究主要探究在擠壓過(guò)程中物料含水量、擠壓溫度以及酶處理時(shí)高溫α-淀粉酶活力對(duì)高粱粉中高粱蛋白提取率和純度的影響，同時(shí)利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化高粱蛋白的提取工藝，并對(duì)提取的高粱蛋白組分進(jìn)行氨基酸組成測(cè)定、營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和亞基分析，為高粱蛋白的深度開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、高溫α-淀粉酶(40 000 U/g)、Braford蛋白測(cè)定試劑盒。

氫氧化鈉、鹽酸、石油醚、十二烷基磺酸鈉(SDS)和2-巰基乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFM110型錘式旋風(fēng)磨；DSE-20型雙螺桿擠壓機(jī)；SpectraMax M2e酶標(biāo)儀；D-3紫外檢測(cè)儀；Cence H850R高速冷凍離心機(jī)；KjelFlex K-360凱氏定氮儀；日立L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀；MINI-4垂直電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 擠壓實(shí)驗(yàn)

將過(guò)60目篩后的微細(xì)高粱粉分裝后，物料含水量分別調(diào)至15%、17%、19%、21%、23%，混合均勻，放入自封袋中平衡過(guò)夜。

采用雙螺桿擠壓機(jī)，長(zhǎng)徑比30∶1，螺桿直徑20 mm，模孔直徑4 mm。擠壓機(jī)套筒溫度分別設(shè)定為Ⅰ區(qū)40 ℃、Ⅱ區(qū)60 ℃、Ⅲ區(qū)100 ℃、Ⅳ區(qū)120 ℃，Ⅴ區(qū)溫度分別設(shè)定為 120、135、150、165、180 ℃，喂料器轉(zhuǎn)速恒定為14 r/min，螺桿轉(zhuǎn)速恒定為150 r/min。擠壓機(jī)啟動(dòng)30 min穩(wěn)定后，按設(shè)定的條件對(duì)混合樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。擠出樣品放置于40 ℃烘箱干燥24 h，分別磨粉過(guò)60目篩用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 淀粉酶法制備高粱蛋白

將未經(jīng)擠壓的高粱粉和擠壓后的高粱粉按照料液比1∶6(高粱粉∶超純水)于90 ℃恒溫水浴鍋中攪拌，添加適量的高溫α-淀粉酶(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4和2.8 U/g淀粉)，反應(yīng)2 h后，5 000 r/min，4 ℃下離心15 min，傾倒上清液后取沉淀，反復(fù)水洗沉淀并離心3次，直至上清液澄清，將沉淀冷凍干燥即得高粱蛋白粉。

1.3.3 高粱蛋白的提取率和純度的計(jì)算

稱量冷凍干燥后的高粱蛋白粉的質(zhì)量，使用Braford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定高粱蛋白粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算提取率和純度，根據(jù)式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m1是冷凍干燥后的所提取高粱蛋白粉質(zhì)量/g，C1是冷凍干燥后的高粱蛋白粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%，即高粱蛋白純度，C0是高粱或擠壓高粱粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%，m是高粱或擠壓高粱粉質(zhì)量/g。

1.3.4 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)。以物料含水量、擠壓溫度、淀粉酶活力為實(shí)驗(yàn)因素，以蛋白質(zhì)純度為響應(yīng)值，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3.5 氨基酸分析

準(zhǔn)確稱取 0.1 g高粱蛋白于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，(減壓條件下) 密封水解管放入烘箱，110 ℃水解24 h。將水解后的樣品過(guò)濾，放入圓底燒瓶中旋蒸去除鹽酸。殘留樣品用0.02 mol/L HCl定容至50 mL，吸取稀釋后的水解液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，裝入進(jìn)樣瓶中通過(guò)氨基酸分析儀測(cè)定。采用堿水解的方法測(cè)定色氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

氨基酸評(píng)分(AAS)=

(2)

式中:以1973年FAO/WHO推薦的模式(學(xué)齡前兒童)為參考蛋白。

(3)

預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)功效比值(PER)：

PERⅠ=-0.684+0.456(Leu)-0.047(Pro)

(4)

PERⅡ=-0.468+0.454(Leu)-0.105(Try)

(5)

PERⅢ=-1.816+0.435(Met)+0.780(Leu)+0.211(His)-0.944(Try)

(6)

1.3.7 SDS-PAGE凝膠電泳

稱取50 mg高粱蛋白，加入1 mL緩沖溶液中(0.05 mL 2-ME、0.67 mL 去離子水和0.28 mL混合液，其中含有0.2 mol/L的HCl、7% SDS、30%甘油和4% Pyronin Y)，充分混勻。加入蛋白質(zhì)樣品，150 mA下保持18 h電泳結(jié)束[13]。使用考馬斯亮藍(lán)染液搖床染色過(guò)夜，脫色，掃描凝膠圖像。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 8.0和SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用Tukey法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以X±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶法提取高粱蛋白

如表2所示，對(duì)未經(jīng)擠壓處理的高粱粉直接進(jìn)行α-淀粉酶水解處理，發(fā)現(xiàn)蛋白提取表現(xiàn)出高提取率和低蛋白質(zhì)純度。這說(shuō)明在高粱中，直接使用α-淀粉酶無(wú)法完全水解淀粉。這與高粱中淀粉和蛋白質(zhì)的結(jié)合方式有關(guān)。高粱淀粉與蛋白質(zhì)結(jié)合形成包埋結(jié)構(gòu)，淀粉酶難以有效接觸淀粉，使得產(chǎn)物中蛋白質(zhì)依舊與淀粉緊密結(jié)合，導(dǎo)致最終產(chǎn)物的提取率高，但蛋白質(zhì)純度極低。

表2 淀粉酶法提取高粱蛋白

2.2 擠壓協(xié)同淀粉酶提取高粱蛋白

2.2.1 物料水分對(duì)于高粱蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

由圖1可知，當(dāng)擠壓溫度為150 ℃，淀粉酶活力為2.0 U/g淀粉時(shí)，高粱粉經(jīng)擠壓協(xié)同α-淀粉酶處理后，蛋白質(zhì)提取率81.48%～83.90%，純度65.44%～75.77%。相對(duì)于α-淀粉酶直接處理，蛋白質(zhì)純度提升了4.2～5.2倍。同時(shí)提取率保持在較高水平。這與淀粉在擠壓機(jī)機(jī)桶內(nèi)的糊化和降解相關(guān)。淀粉在溫度、壓力和剪切力的共同作用下發(fā)生糊化和降解。淀粉糊化過(guò)程中分子間氫鍵斷裂，致密有序的淀粉結(jié)構(gòu)變得松散無(wú)序，內(nèi)部空間增大，在酶水解過(guò)程中有利于α-淀粉酶的進(jìn)入，導(dǎo)致酶解效率增強(qiáng)。這一過(guò)程使得高粱中淀粉-蛋白質(zhì)包埋結(jié)構(gòu)被完全瓦解，蛋白質(zhì)得以釋放，從而能夠通過(guò)離心沉淀的方式分離得到純度較高的高粱蛋白。

如圖1所示，高粱蛋白的提取率隨物料含水量增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)物料含水量從 17%上升至19%時(shí)，提取率急劇上升。當(dāng)物料含水量超過(guò)19%時(shí)，提取率不斷降低。蛋白質(zhì)純度隨物料含水量的變化趨勢(shì)與提取率的變化趨勢(shì)一致。在物料含水量19%的條件下，蛋白質(zhì)提取率與純度有最大值，分別為83.90%和75.77%。在擠壓過(guò)程中，物料含水量增加，淀粉充分吸水，淀粉糊化度增加[14]，擠壓過(guò)程使得淀粉結(jié)構(gòu)松散，從而對(duì)α-淀粉酶更加敏感，酶解過(guò)程中易于生成小分子量的易溶于水的物質(zhì)，蛋白質(zhì)因此在離心過(guò)程中沉淀并與淀粉分離開(kāi)來(lái)。同時(shí)，水分在機(jī)筒中對(duì)淀粉等物質(zhì)有塑化作用[15]，改善物料的流動(dòng)性，因此，當(dāng)物料水分含量進(jìn)一步升高，機(jī)械能下降，淀粉的降解程度有所降低，α-淀粉酶水解效率降低，導(dǎo)致提取率降低，蛋白質(zhì)純度下降。

圖1 物料含水量對(duì)蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

2.2.2 擠壓溫度對(duì)于高粱蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

如圖2所示，當(dāng)物料水分為17%，淀粉酶活力為2.0 U/g淀粉時(shí)，隨擠壓溫度的增加，蛋白質(zhì)提取率和純度都呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。擠壓溫度是影響淀粉糊化和降解程度的重要因素。擠壓溫度增加，淀粉糊化度增加，α-淀粉酶水解淀粉的效率也隨之增大，淀粉-蛋白質(zhì)包埋結(jié)構(gòu)的破壞程度增加，因此可以得到較高純度的蛋白質(zhì)，提取率也升高。在擠壓溫度150 ℃的條件下，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到82.12%，純度達(dá)到75.38%。 但當(dāng)溫度高于150 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率和純度呈下降趨勢(shì)。過(guò)高的擠壓溫度有可能導(dǎo)致淀粉與脂肪、蛋白質(zhì)的結(jié)合[16]，不利于淀粉酶的水解作用；此外，PHILIPP 等[17]認(rèn)為擠壓溫度的增加降低了機(jī)筒內(nèi)熔融體的黏度，物料受到的剪切力下降，擠壓過(guò)程中淀粉的降解程度降低，α-淀粉酶水解效率降低，蛋白質(zhì)提取率和純度降低。隨著擠壓溫度上升到180 ℃，機(jī)筒內(nèi)蛋白質(zhì)變性程度增加，蛋白質(zhì)的水溶性降低，還可能產(chǎn)生淀粉的焦化現(xiàn)象，引起蛋白質(zhì)提取率和純度的快速下降。

圖2 擠壓溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

2.2.3 α-淀粉酶活力對(duì)于高粱蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

如圖3所示，當(dāng)擠壓溫度為150 ℃，水分為17%時(shí)，隨著酶活力的增加，蛋白質(zhì)提取率和純度呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶活力達(dá)到 2.0 U/g淀粉之后，蛋白質(zhì)提取率和純度變化不大，趨于穩(wěn)定。α-淀粉酶通過(guò)水解蛋白質(zhì)周?chē)牡矸?，使得更多的蛋白質(zhì)暴露出來(lái)。經(jīng)過(guò)擠壓后，糊化的淀粉更易于被α-淀粉酶水解，轉(zhuǎn)化為可溶于水的小分子物質(zhì)。當(dāng)?shù)孜?淀粉)的量一定時(shí)，酶活力的增加提升了淀粉酶與淀粉的接觸概率，催化了更多的淀粉水解，從而破壞淀粉分子間結(jié)構(gòu)以及淀粉與蛋白質(zhì)的包埋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率和純度增加。當(dāng)?shù)矸勖富盍?.0 U/g淀粉時(shí)，酶與底物的結(jié)合達(dá)到飽和，繼續(xù)增加酶活力，蛋白質(zhì)純度和提取率趨于穩(wěn)定。

圖3 淀粉酶活力對(duì)蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

2.2.4 擠壓協(xié)同α-淀粉酶提取高粱蛋白條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以蛋白質(zhì)純度為測(cè)定指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4的方差分析結(jié)果可知，F(xiàn)0.1F0.01，酶活力對(duì)蛋白質(zhì)純度有極顯著影響。3個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響先后順序是C>B>A，即酶活力>物料含水量>擠壓溫度。綜合各因素作用，得到高粱擠壓協(xié)同淀粉酶法提取獲得高純度蛋白的最佳提取條件是C3B2A3，即淀粉酶活力2.0 U/g淀粉，物料含水量19%，擠壓溫度165 ℃。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，高粱蛋白質(zhì)純度79.23%，提取率83.2%。

表4 SPSS 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.3 高粱蛋白的氨基酸組成分析及營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)

由表5可知，擠壓協(xié)同淀粉酶法提取的高粱蛋白中除了蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸，其他的氨基酸的AAS均大于1，均能滿足FAO/WHO推薦的學(xué)齡前兒童的氨基酸需求。賴氨酸、色氨酸等氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低是由高粱蛋白的必需氨基酸組成合理性欠缺所引起；蘇氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低與擠壓過(guò)程有關(guān)。在擠壓過(guò)程中，高溫高壓條件使得氨基酸殘基暴露，并與原料中存在的某些還原糖或羰基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)或非酶促褐變反應(yīng)，使得氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。相對(duì)于杜金娟[5]的研究而言，此法提取的高粱蛋白中亮氨酸、谷氨酸和丙氨酸等氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著提高。這可能是由于杜金娟采用提取方法為堿法提取，其中的蛋白質(zhì)組成成分主要為高粱谷蛋白，而淀粉酶法提取主要去除高粱粉中的淀粉，提取的高粱中的蛋白質(zhì)相對(duì)較完全。

表5 高粱蛋白氨基酸組分分析

從表6中高粱蛋白的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)可知，擠壓協(xié)同淀粉酶法提取的高粱蛋白中必需氨基酸與總量的比例為38.03%，高于FAO/WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)，表現(xiàn)出良好的氨基酸平衡。PER常作為蛋白質(zhì)吸收利用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，PER越大其吸收利用越高。擠壓協(xié)同淀粉酶法提取的高粱蛋白PERⅠ、PERⅡ和PERⅢ均大于2.0，說(shuō)明本法提取的高粱蛋白氨基酸利用率較高，可以被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。

表6 高粱蛋白的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

2.4 高粱蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分析

擠壓協(xié)同淀粉酶法提取的蛋白質(zhì)(SP2)經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)R250染色后的電泳圖譜見(jiàn)圖4。與Marker對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，SP2主要有4個(gè)條帶，其中1條相對(duì)分子質(zhì)量位于24～31 ku，其余3條相對(duì)分子質(zhì)量分別為43、37、15 ku。24～31 ku處的條帶范圍廣，說(shuō)明此范圍內(nèi)蛋白質(zhì)亞基較為集中。高粱中醇溶蛋白主要分為3種：α-醇溶蛋白(23～25 ku)、β-醇溶蛋白(16～20 ku)和 γ-醇溶蛋白(28 ku)。這說(shuō)明SP2 中24-31 ku的條帶幾乎包含所有的醇溶蛋白組分。Vivas等[18]對(duì)蒸煮前后高粱中的谷蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)蒸煮前后的高粱中谷蛋白均能在36、45 ku處得到條帶，這說(shuō)明SP2中43、37 ku的條帶代表谷蛋白。杜金娟等[19]利用堿法提取甜高粱中的谷蛋白，電泳圖在15.1 ku處出現(xiàn)條帶并推斷此條帶是谷蛋白降解所致。所以SP2中的15 ku同樣代表了高粱蛋白中的谷蛋白。由此可知，擠壓協(xié)同淀粉酶法制備的高粱蛋白包含醇溶蛋白和谷蛋白。

現(xiàn)在常用的高粱蛋白提取法有有機(jī)溶劑法、還原劑法、超聲波輔助提取法和堿法。對(duì)這些方法提取的高粱蛋白進(jìn)行相對(duì)分子量分析[19-22]，圖譜中均缺少SP2中位于43和37 ku處的條帶。這說(shuō)明相對(duì)于現(xiàn)行的高粱蛋白提取方法，擠壓協(xié)同淀粉酶法能夠更加完全的提取出高粱中存在的蛋白質(zhì)組分。

圖4 高粱蛋白的SDS-PAGE圖譜

3 結(jié)論

研究物料含水量、擠壓溫度和淀粉酶活力對(duì)于擠壓協(xié)同淀粉酶法制備高粱蛋白的提取率和純度的影響，并以此為基礎(chǔ)，利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)高粱蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用氨基酸分析儀和SDS-PAGE凝膠電泳儀分析本法提取的高粱蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著物料含水量或溫度的增加，蛋白提取率和純度均先上升后下降，在物料含水量19%或150 ℃時(shí)有最大值；隨著酶活力的增加，提取率和純度也隨之增加，當(dāng)酶活力2.0 U/g淀粉時(shí)趨于平緩。在最佳工藝條件(物料含水量19%，擠壓溫度165 ℃和淀粉酶活力2.0 U/g淀粉)時(shí)，高粱蛋白提取率83.2%，純度79.23%。本法提取的高粱蛋白包含高粱醇溶蛋白和谷蛋白，并且具有良好的氨基酸平衡和較高的氨基酸利用率。與傳統(tǒng)提取工藝相比，擠壓協(xié)同淀粉酶法綠色高效，有更好的工業(yè)化前景。