胡蘿卜黑斑病抗性的動態(tài)遺傳分析

歐承剛曹瓊文趙志偉任懷富李成江*莊飛云，3*

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2宿州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽宿州 234000；3西寧市蔬菜研究所，青海西寧 810016）

胡蘿卜黑斑?。ˋlternaria leaf blight）是由半知菌亞門鏈格孢屬胡蘿卜鏈格孢菌（Alternaria dauci）引起的，是全球胡蘿卜生產(chǎn)中危害最為普遍的病害之一，發(fā)病重者可直接導(dǎo)致胡蘿卜減產(chǎn)40%～60%（Vintal et al.，1999；歐承剛 等，2009），而且可以危害其他傘形花科作物，甚至十字花科的蘿卜等（Boedo et al.，2012）。據(jù)調(diào)查，黑斑病在河北、內(nèi)蒙古、安徽、山東及河南等胡蘿卜主要種植基地時(shí)有發(fā)生，特別是在高溫多雨季節(jié)?；瘜W(xué)防治在一定程度上能減緩黑斑病的危害，但只有通過遺傳改良，提高品種抗性，才能確保胡蘿卜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

國內(nèi)胡蘿卜黑斑病抗性資源評價(jià)鑒定、遺傳研究及品種選育的相關(guān)研究較為薄弱（方智遠(yuǎn)，2017）。國外對于胡蘿卜黑斑病抗性種質(zhì)的研究報(bào)道較早，篩選出胡蘿卜黑斑病不同抗性水平的種質(zhì)，但沒有免疫的種質(zhì)（Strandberg et al.，1972；Pryor et al.，2002；Pawelec et al.，2006；Boedo et al.，2010）。利用半同胞家系群體估算出黑斑病抗性的狹義遺傳率為40.3%，廣義遺傳率為45.6%～81.9%，抗性遺傳存在顯著的加性效應(yīng)，受多基因控制（Vieira et al.，1991；Boiteux et al.，1993；Simon & Strandberg，1998）。le Clerc等（2015）檢測到11個(gè)與黑斑病抗性相關(guān)的QTL，表型貢獻(xiàn)率為4.8%～43.8%，其中9個(gè)QTL來自抗病親本，2個(gè)QTL來自感病親本；兩個(gè)供試群體的抗性遺傳率分別為75%和78%，說明其遺傳特性受環(huán)境影響較小；但是受制于標(biāo)記類型和數(shù)量，其QTL顯著性區(qū)間范圍較大（3.6～50.5 cM），難以用于抗性基因的克隆以及抗性種質(zhì)的分子標(biāo)記輔助選擇。

植物抗病性是一個(gè)復(fù)雜性狀，是宿主與病原菌互作的綜合表現(xiàn)，受1個(gè)或多個(gè)抗病基因的控制，抗病基因的表達(dá)具有時(shí)空特異性（Neik et al.，2017；Wang et al.，2017；Li et al.，2018），所以抗病性的表現(xiàn)也呈動態(tài)變化過程。具有時(shí)空秩序性表達(dá)的基因，其調(diào)控機(jī)制在不同發(fā)育階段會發(fā)生顯著變化，因此深入探討目標(biāo)性狀的動態(tài)變化的遺傳規(guī)律，對提高育種的預(yù)見性和選擇效率具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值（陳幼玉 等，2005）。本試驗(yàn)利用加性-顯性遺傳模型（朱軍，1997）分析不同基因型胡蘿卜自交系及其雜交組合的黑斑病抗性動態(tài)遺傳規(guī)律，估算控制抗性遺傳的遺傳效應(yīng)，分析黑斑病抗性遺傳研究的適宜時(shí)期，為篩選抗性材料及黑斑病抗性基因的挖掘提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所多代純化育成的18份橘色胡蘿卜自交系和1份地方品種為試材，分別為KNP11（P1，長圓柱形）、KN001（P2，圓柱形）、KN015（P3，圓柱形）、KN024（P4，圓柱形）、KN035（P5，圓柱形）、N078（P6，圓柱形）、KN094（P7，圓柱形）、KN104（P8，圓柱形）、N111（P9，圓柱形）、KN120（P10，圓柱形）、KN122（P11，圓柱形）、KN133（P12，長圓柱形）、KN144（P13，長圓柱形）、K162（P14，短圓錐形）、K169（P15，長圓錐形）、N217（P16，長圓柱形）、N220（P17，長圓柱形）、N243（P18，細(xì)短圓柱形）和潛山胡蘿卜（P19，長圓柱形）。其中P6、P9、P16～P19為南特類型，P14和P15為黑田類型，其余為黑田與南特雜合型。

2016年7月中下旬在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京昌平綜合試驗(yàn)基地露地播種，11月中旬采收肉質(zhì)根貯藏于地窖。2017年3月進(jìn)行種根定植，5月初進(jìn)入始花期，采用人工去雄授粉和不完全雙列雜 交的方法配制63個(gè)雜交組合F1（表1）。2017年8月初將上述親本材料及組合種子播種于安徽省蕭縣胡蘿卜多年連作基地，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)，株距5 cm，行距20 cm，每小區(qū)種植50～60株，常規(guī)管理。

1.2 調(diào)查方法

采用田間自然發(fā)病，以中抗品種Bolero（Corbaz &Perko，1995；le Clerc et al.，2009）為參照，分別于2017年10月13日（發(fā)病早期）、11月2日（發(fā)病中期）和11月22日（發(fā)病晚期，肉質(zhì)根收獲），根據(jù)小區(qū)的發(fā)病程度調(diào)查親本及F1的病級指數(shù)，調(diào)查方法及分級標(biāo)準(zhǔn)參照曹瓊文等（2018）的方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

參照朱軍（1997）提出的基于混合線性模型的加性-顯性遺傳模型，利用QGAStation 2.0分析軟件（Chen et al.，2012）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。估算病級指數(shù)的各項(xiàng)非條件方差分量（加性方差VA、顯性方差VD和表型方差Vp）和遺傳率，采用Jackknife數(shù)值抽樣方法，估算各項(xiàng)遺傳參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤，并檢驗(yàn)各遺傳參數(shù)的顯著性；參照Zhu（1995）的條件分析方法，估算病級指數(shù)在生育期t-1階段到t階段的條件方差分量〔VA（t|t-1）和VD（t|t-1）〕。采用SPSS v15.0軟件進(jìn)行親本和F1各時(shí)期病級指數(shù)的方差分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F1的黑斑病病級指數(shù)分布

圖1顯示隨著發(fā)病時(shí)期的延長，親本和F1的平均病級指數(shù)顯著增加，變異幅度也增大。早期親本和F1的平均病級指數(shù)分別為0.78和0.48，中期的平均病級指數(shù)分別為1.93和1.37，晚期的平均病級指數(shù)分別達(dá)到2.79和1.93。各親本和組合在3個(gè)時(shí)期分別表現(xiàn)不同程度的抗病性，其中早期P10、早期和中期P19的病級指數(shù)最低，為0；晚期P2的病級指數(shù)最高，為4.25；早期有11個(gè)F1的病級指數(shù)為0，晚期有2個(gè)F1的病級指數(shù)最高，為4.00（表1）。對照品種Bolero在中期和晚期的病級指數(shù)（1.50和3.25）與親本病級指數(shù)的中位數(shù)一致（圖1），與前人研究結(jié)果相似（le Clerc et al.，2009）。親本的病級指數(shù)在3個(gè)時(shí)期之間呈極顯著正相關(guān)，早期與中期、中期與晚期之間的相關(guān)性系數(shù)r分別是0.781和0.879。F1的病級指數(shù)在3個(gè)時(shí)期之間也呈極顯著正相關(guān)，早期與中期、中期與晚期之間的相關(guān)性系數(shù)r分別是0.816和0.895。

圖1 親本、F1以及對照Bolero的病級指數(shù)分布

表1 供試親本及F1的病級指數(shù)

2.2 黑斑病病級指數(shù)的遺傳效應(yīng)分析

非條件遺傳方差分析結(jié)果表明，黑斑病病級指數(shù)的遺傳效應(yīng)以加性方差VA為主（表2），發(fā)病中期和晚期均達(dá)到顯著水平，分別為0.656和0.551，分別占表型方差VP的57.4%和55.2%。顯性方差VD在晚期達(dá)到顯著水平，為0.311，占表型方差VP的31.2%。

條件遺傳方差可以顯示不同發(fā)病時(shí)期控制黑斑病病級指數(shù)的凈遺傳效應(yīng)。由表2可知，中期的加性方差〔VA（t|t-1）〕達(dá)到顯著水平，占表型方差的41.2%，而晚期的顯性方差〔VD（t|t-1）〕達(dá)到極顯著水平，占表型方差的56.7%。

2.3 親本黑斑病病級指數(shù)的加性效應(yīng)分析

表2 不同發(fā)病時(shí)期黑斑病病級指數(shù)的方差分量估計(jì)值

各親本在不同發(fā)病時(shí)期表現(xiàn)的加性效應(yīng)不同（圖2），早期和中期均有9個(gè)親本表現(xiàn)為正向效應(yīng)，10個(gè)為負(fù)向效應(yīng)，其中P1、P14和P16在早期的加性效應(yīng)達(dá)到顯著水平，而P1、P2、P12和P15在中期達(dá)到顯著水平。發(fā)病晚期有10個(gè)親本表現(xiàn)為正向效應(yīng)，9個(gè)為負(fù)向效應(yīng)，其中P4、P6、P17和P18的加性效應(yīng)達(dá)到顯著水平。

圖2 親本黑斑病病級指數(shù)的加性效應(yīng)

2.4 黑斑病病級指數(shù)的遺傳率

黑斑病病級指數(shù)的狹義遺傳率在中期和晚期達(dá)到顯著水平（表3），分別為0.574和0.552。廣義遺傳率僅在中期達(dá)到顯著水平，為0.827，說明遺傳變異在后代表型變異中占主要成分。

表3 黑斑病病級指數(shù)的遺傳率

3 結(jié)論與討論

抗病遺傳研究是挖掘抗性基因、開展抗病育種的重要基礎(chǔ)（方智 ，2017）?，F(xiàn)有研究表明胡蘿卜黑斑病抗性為數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，尚未獲得相關(guān)抗性基因Vieira et al.，1991；Boiteux et al.，1993；Simon & Strandberg，1998；le Clerc et al.，2009，2015）。本試驗(yàn)基于混合線性模型的加性-顯性遺傳模型 朱軍，1997），以非等試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的非平衡數(shù) （左清凡 等，2000），分析不同發(fā)病時(shí)期胡蘿卜黑斑病病級指數(shù)的非條件和條件遺傳效應(yīng)。非條件分析結(jié)果顯示黑斑病病級指數(shù)的加性遺傳效應(yīng)在發(fā)病中期和晚期達(dá)到顯著水平，最高占表型遺傳的57.4%（表2），說明后代的抗性水平主要受親本的加性效應(yīng)影響，通過親本的選擇有助于提高后代的抗性；顯著的顯性遺傳效應(yīng)說明在晚期抗性遺傳存在雜種優(yōu)勢效應(yīng)，利用雜種優(yōu)勢可以提高雜交后代的抗性水平，這與親本和F1的病級指數(shù)分布一致（圖1）；由于加性效應(yīng)高于顯性效應(yīng)，也表明選擇抗性親本的效果優(yōu)于雜種優(yōu)勢的利用。

非條件遺傳分析方法反映的是全部遺傳效應(yīng)的累加效應(yīng)，而條件遺傳分析方法是對特定時(shí)期（t|t-1）抗病基因表達(dá)的凈遺傳效應(yīng)進(jìn)行分析，可以有效排除前期已表達(dá)基因所產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)，獲得該時(shí)期的動態(tài)遺傳表達(dá)規(guī)律，分析不同時(shí)期遺傳表達(dá)效應(yīng)的異同（Zhu，1995；石春海 等，2002；Xu et al.，2011）。條件遺傳分析顯示，本試驗(yàn)在發(fā)病中期加性效應(yīng)顯著增加〔VA（t|t-1）= 0.179，表2〕，說明黑斑病抗性基因的表達(dá)存在時(shí)序性，發(fā)病中期是基因表達(dá)最活躍的時(shí)期，所以導(dǎo)致累積的非條件加性效應(yīng)值在中期（VA= 0.656）最高，晚期反而下降，因此，該時(shí)期也是抗病基因挖掘、基因表達(dá)規(guī)律分析等研究的適宜時(shí)期；顯性效應(yīng)在晚期顯著增加〔VD（t|t-1）= 0.154〕，導(dǎo)致累積的非條件顯性效應(yīng)值在晚期（VD= 0.311）最高，說明這個(gè)時(shí)期黑斑病抗性的雜種優(yōu)勢效應(yīng)最顯著。

顯著的狹義遺傳率和廣義遺傳率最高為0.574和0.827，這與Vieira等（1991）和Boiteux等（1993）的結(jié)果（40.3%～81.9%）相近，說明通過遺傳改良的方法可以顯著提高后代抗性（le Clerc et al.，2009）。本試驗(yàn)有5個(gè)親本（P1、P2、P4、P6和P18）分別在不同發(fā)病時(shí)期表現(xiàn)為顯著的正向加性效應(yīng)（圖2），說明這5個(gè)親本的選擇、純化會提高后代病級指數(shù)，即降低后代抗病性；有5個(gè)親本（P12、P14、P15、P16、P17）分別在不同發(fā)病時(shí)期表現(xiàn)為顯著的負(fù)向加性效應(yīng)，說明這5個(gè)親本的選擇、純化可以減小后代病級指數(shù)，即增加后代抗病性。P1的遺傳效應(yīng)表現(xiàn)較為穩(wěn)定，在早期和中期都具有顯著的正向加性效應(yīng)；P3、P7和P13的遺傳效應(yīng)則不穩(wěn)定，早期的加性效應(yīng)為負(fù)值（或正值），到中、晚期為正值（或負(fù)值）。供試親本中，有11個(gè)黑田與南特雜合型親本，其中有3個(gè)親本（P1、P2和P4）顯著降低后代抗性，僅有1個(gè)親本（P12）顯著增加后代抗性；有6個(gè)南特類型親本，其中2個(gè)親本（P6和P18）顯著降低后代抗性，2個(gè)親本（P16和P17）顯著增加后代抗性；2個(gè)黑田類型親本（P14和P15）均顯著增加后代抗性，但根據(jù)筆者在我國主要胡蘿卜種植區(qū)域多年、多點(diǎn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黑田類型品種的黑斑病抗性水平也存在差異。在Pawelec等（2006）和le Clerc等（2009）的研究中也顯示高感品種Presto和中抗品種Bolero均為南特類型。由此說明，親本類型與黑斑病抗性并不具有一致性，但通過遺傳分析可以從不同類型的材料中篩選出能夠提高后代抗性的親本。此外，親本間遺傳效應(yīng)的差異以及親本自身不同時(shí)期遺傳效應(yīng)的變異，表明不同親本中抗病基因的表達(dá)及其遺傳調(diào)控模式可能不盡相同。上述研究結(jié)果為抗病種質(zhì)的篩選、遺傳機(jī)制的研究以及抗病基因的遺傳定位分析提供了理論依據(jù)。